Тема 2. Виготовлення антигенів та сироваток крові

Виготовлення клітинних (корпускулярних) антигенів. Для постановки серологічних реакцій, в якості антигену, використовують суспензію живої (18–24-годинної) культури в ізотонічному розчині натрію хлориду або суспензію культури, інактивованої (вбитої) прогріванням.

Для виготовлення антигену використовують культуру в S-формі (колонії на МПА гладенькі, блискучі), яка в ізотонічному розчині утворює гомогенну суспензію. Штами в R-формі дають спонтанну аглютинацію, тому їх не можна використовувати як антиген.

Для виготовлення антигену спочатку виділяють культуру на скошеному МПА. Отриману чисту культуру змивають стерильним ізотонічним розчином. Для цього в пробірку з ростом культури наливають 4–5 мл стерильного ізотонічного розчину, пробірку закривають пробкою і, тримаючи між долонями рук, енергійно обертають пробірку навколо осі. Отриману суспензію бактерій переливають у чисту суху стерильну пробірку і, порівнюючи з оптичним стандартом каламутності, розводять ізотонічним розчином до концентрації 2 млрд мікробних клітин в 1 мл.

Стандартні антигени відомих збудників інфекційних хвороб виробляють на біофабриках. Вони містять інактивовані (не живі) бактерії. Ці антигени називають д і а г н о с т и к у м а м и (від грец. diagnostikos – здатний розпізнавати). Діагностикуми випускають, як правило, у рідкому стані (з консервантом) та ліофільно висушеними в ампулах або флаконах (для попередження псування).

Перед використанням діагностикум перевіряють на придатність. Звертають увагу на цілість ємності, чіткість напису на ампулі чи флаконі, відповідність його надпису, зазначеному у наставленні й на коробці, відповідність зовнішнього вигляду, термін придатності.

Перед використанням діагностикум збовтують. Він повинен бути рівномірно каламутним, не утворювати пластівці. Ліофілізований діагностикум розчиняють так, як зазначено у наставленні.

Клітинні або корпускулярні антигени використовуються у таких серологічних реакціях як аглютинації, зв’язування комплементу, гемаглютинації та її варіантах.

Виготовлення гуморальних (розчинних) антигенів. Антигени (специфічні білки бактерій) резистентні до нагрівання (кип’ятіння, автоклавування) та гниття. При цьому вони не руйнуються і зберігають свою специфічність. Їх отримують екстрагуванням бактерій у яких повністю зруйнована клітинна стінка, тканин, які містять збудників хвороби тобто з біологічного матеріалу, який надсилають для дослідження. Існують фізичні та хімічні методи отримання антигенів.

Ф і з и ч н і м е т о д и екстрагування антигенів основані на механічному руйнуванні мікробних клітин шляхом розтирання з кварцевим піском, багаторазове заморожування та розморожування, дія ультразвуку.

У практиці використовують слідуючі методи виготовлення:

а) механічне руйнування – густу масу відмитих фізрозчином бактерій або подрібнених шматочків органів розтирають у стерильній ступці з піском чи скляним порошком, потім заливають невеликою кількістю фізрозчину, залишають за кімнатної температури на 30 – 40хв, ценрифугують (або фільтрують через фільтрувальний папір чи ватно-марлевий тампон) до отримання прозорої рідини, яку і використовують як антиген;

б) заморожування та розморожування декілька разів густої суспензії бактерій чи тканин, що містить збудник, або інший білок, який виступає в ролі антигену. Заморожування призводить до руйнування клітинної стінки бактерій чи клітин, уражених вірусом та виходу протоплазми у розчин. Після центрифугування надосадову рідину (антиген) використовують в реакції;

в) метод звукових коливань – застосовують спеціальні апарати з особливим зумером. Прилад занурюють у рідину з суспензією бактерій і включають – клітини руйнуються як при дії ультразвуку. Рідину фільтрують (до абсолютної прозорості) або центрифугують і використовують для дослідження;

г) кип’ятіння – найбільш розповсюджений метод отримання преципітиногену (антиген для реакції преципітації) – бактеріальну суспензію (подрібнену шкіру, патологічний матеріал) у фізіологічному розчині кип’ятять 1–2 год (на водяній бані), фільтрують через азбестову вату. Отриманий прозорий фільтрат – антиген – має високу специфічність;

д) довготривале (холодним способом) екстрагування фізрозчином при кімнатній температурі. Шматочки досліджуваного матеріалу масою 1–2 г розтирають у ступці з піском, кладуть у колбу заливають 0,3% карболізованим фізрозчином у співвідношенні 1:10 і залишають на 18–24 год. Одержані екстракти фільтрують через азбестову вату і використовують для реакції. У всіх випадках отриманий антиген повинен бути абсолютно прозорим.

З х і м і ч н и х методів отримання антигенів достатньо широко використовують екстрагування трихлороцтовою кислотою; кислотний або лужний термогідроліз – прогрівання матеріалу, наприклад, в 1 %-му розчині оцтової кислоти або 0,1 н. розчині гідроксиду натрію; екстрагування при допомозі ацетону, сечовини, етилового спирту, ефіру та інших розчинників; використовують методи ферментативного руйнування мікробних клітин, наприклад, під дією трипсину.

Вибір того чи іншого способу виділення розчинного антигену залежить від його хімічної природи. Головною умовою до любого з методів – ефективне вилучення антигену без його денатурації.

Гуморальним антигеном також може бути бактеріальний екзотоксин. Ним може бути фільтрат бактеріальної культури вирощеної у рідкому живильному середовищі, екстракт вмісту шлунку, кишечнику, проб корму.

Досліджуваний матеріал в якому припустимзнаходиться токсин розводять ізотонічним розчином у відношенні 1: 1, екстрагують при кімнатній температурі 1 годину, фільтрують через ватно-марлевий фільтр та центрифугують при 5000 об/хв 20 хв. Надосадова рідина буде являтись антигеном.