Крапельний (пластинчатий) метод РА

Цей метод РА використовують з метою швидкої орієнтувальної ідентифікації (типізації) збудника чи антитіл у кров'яній сироватці.

Для типізації збудників на предметне скло (лівий край) наносять краплю відомої специфічної сироватки, а на правий край скла краплю фізрозчину (для контролю). В кожну краплю бактеріологічною петлею додають культуру досліджуваного мікроба, вирощеного на МПА (антиген) і рівномірно розмішують. Результат враховують через 2–3 хвилини.

При позитивній реакції у краплі з аглютинуючою сироваткою з’являються пластівці, крупинки. Рідина стає прозорою. У контрольній краплі рідина залишається каламутною, а пластівці і крупинки не утворюються. Реакція краще роздивляється на темному фоні (рис. 5).

 

 

Пластинчата РА – розбенгал проба (РБП)

 

Використовується ця реакція для діагностики бруцельозу. При постановці цієї реакції використовують антиген (мікробна завісь інактиваваного збудника бруцельозу) пофарбований бенгальським рожевим. Реакцію сталять на металевих емальованих (білих) пластинках з лунками. В лунки вносять мікропіпеткою досліджувану сироватку у дозі 0,03 мл і додають 0,03 мл антигену. Аглютинацію враховують через 4 хв після змішування. Реакція вважається позитивною при наявності вираженої аглютинації пофарбованих (вбитих) бруцел у вигляді пластівців та крупинок рожевого кольору, які чітко виділяються на білому фоні лунки.

 

Реакція гемаглютинації (РГА)

Гемаглютинація (від грец. haima – кров та лат. agglutinatio – склеювання) – склеювання та випадіння у осад еритроцитів, що знаходяться в рідині під дією різних агентів (антигенів) (рис. 6).

Розрізняють 2 види гемаглютинації:

а) пряму, або активну, яка основана на здатності бактерій деяких видів (та вірусів) адсорбуватись на поверхні еритроцитів тварин різних видів, викликаючи їх склеювання та осідання. Ця реакція є неспецифічною, еритроцити тварин одного і того ж виду можуть адсорбувати різні антигени;

б) непряму або пасивну гемаглютинацію (РНГА), коли еритроцити попередньо сенсибілізовані антигеном, аглютинуються сироваткою, імунною до цього антигену (рис. 7). Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА) є специфічною і може бути використана для серологічної діагностики бактерійних та вірусних інфекцій (чума, пулороз, туляремія, холера, черевний тиф, сипний тиф, мікоплазмози та ін.).

Для постановки РНГА попередньо готують діагностикум (еритроцити, на яких адсорбований антиген). Для цього беруть у тварин (найчастіше барана) кров, дефібринують її, відмивають фосфатно-буферним розчином (рН 7,2) методом центрифугування, тричі. Останнім часом, для довготривалого збереження та попередження лізису еритроцити обробляють формаліном. Після контакту еритроцитів з формаліном, їх також декілька разів відмивають фосфатно-буферним розчином. Антигени поліцукрової природи легко адсорбуються на поверхні еритроцитів. Для адсорбції антигену білкової природи еритроцити обробляють таніном у розведенні 1:200000. Змішують танізовані еритроцити з антигеном і залишають для адсорбції (сенсибілізації) на 2 год в термостаті (37°С), потім знову відмивають фосфатно-буферним розчином методом центрифугування. Осад розводять фізрозчином і використовують для реакції. Для цього розливають отриманий еритроцитарний антиген у пробірки (або лунки у плексигласовій дошці) і додають досліджувану сироватку. Суміш струшують і залишають при кімнатній температурі на 2 год, а потім враховують результат.

В позитивних випадках відбудеться аглютинація, тобто осад еритроцитів буде у вигляді пластівців, зерняток, розпреділений по усій поверхні дна пробірки. Це означає, що в досліджуваній сироватці є специфічні антитіла до антигену. В негативних випадках еритроцити не склеюються, а осядуть на дно у вигляді невеликого рівного кружка (гудзика). Реакцію контролюють з допомогою специфічної (позитивної) та нормальної (негативної) сироваток.

 

 

1:200

1-:400

1:800

1:1600

Рис. 6. Реакція гемаглютинації: 1:100... 1:1600 — разведення сироватки крові

 

1:100

 

 

Питання для самоконтролю:

1. Суть реакції аглютинації.

2. Постановка та врахування результатів крапельного методу реакції аглютинації.

3. Постановка та врахування результатів пластинчатого методу роз-бенгал проби.

4. Приготування діагностикуму для РНГА.

5. Постановка РНГА та врахування результатів.