Повреждение рибосом и полисом

При токсических воздействиях на клетки происходит изменение конфигурации эндоплазматического ретикулума и связанных с ним рибосом. Например, при отравлении тринитротолуолом в клетках печени мембраны эндоплазматического ретикулума и расположенные на них рибосомы принимают форму различных завитков, не наблюдающихся в нормальных клетках. Синтез белков осуществляется на полисомах. Угнетение синтеза определенных белков, например синтеза гемоглобина при гипопластической анемии в клетках костного мозга, происходит на фоне уменьшения числа полисом и их распада на отдельные рибосомы.

 

3.1.3. Повреждение генетического аппарата клетки

Нуклеиновые кислоты весьма чувствительны к прямому действию повреждающих агентов, таких как облучение ионизирующей радиацией, ультрафиолетом, видимым светом в присутствии некоторых окрашенных соединений - фотосенсибилизаторов. В значительной мере повреждения нуклеиновых кислот исправляются в результате репарации, которая осуществляется по целому ряду механизмов; в противном случае возникают нарушения в геноме (мутации) и работе системы биосинтеза белка. В последнее время многие необратимые изменения в клетках (например, при интоксикациях или в ходе процесса старения) связывают с повреждением генетического аппарата митохондрий.

 

3.1.4. Необратимое повреждение клеток при острой гипоксии

Среди многих причин, вызывающих повреждение клетки, наиболее частый случай в условиях организма человека - это недостаток кислорода (гипоксия) или же, напротив, избыточное образование радикалов кислорода - так называемый оксидативный стресс.

Недостаток кислорода приводит к снижению синтеза митохондриями аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) из аденозиндифосфорной (АДФ) и ортофосфата. Недостаток АТФ делает невозможным функционирование многих систем клетки, для которых необходима затрата энергии в форме макроэргических связей АТФ. Именно энергетический голод, а не само по себе отсутствие кислорода приводит к нарушению функционирования клеток, а затем и к их повреждению.

Но и наличие кислорода еще не означает полного благополучия. Дело не только в том, есть ли кислород в клетках, но еще и в том, на что он расходуется. Наряду с окислением субстратов тканевого дыхания, конечным этапом которого является перенос электронов на кислород в цепи переноса электронов в митохондриях, в клетках существуют и альтернативные пути восстановления кислорода, приводящие к появлению радикалов кислорода и липидов. Свободные радикалы - высокоактивные частицы, способные разрушать структуры клетки. Вызванные ими повреждения могут нанести клетке непоправимый вред.

Нормоксия и аноксия на уровне отдельной клетки. В опытах с изолированными митохондриями показано, что скорость потребления кислорода этими частицами при наличии субстратов дыхания практически постоянна при всех концентрациях кислорода, вплоть до самых низких, соответствующих напряжению кислорода pO2= 1-2 мм рт. ст. Причина этого явления заключается в высоком сродстве к кислороду конечного переносчика электронов по дыхательной цепи - цитохромоксидазы. Поэтому отдельная клетка «выбирает» весь кислород из окружающей среды до конца, не испытывая кислородного голода, в весьма широком интервале pO2от 70 до 1-2 мм рт. ст. Это приводит к формированию так называемого «кислородного конуса» в тканях.

Схематически кислородный конус представлен на рис.2. Для простоты кровеносный сосуд изображен в виде трубки постоянного диаметра, а ткань - в виде однородной структуры, состоящей из одинаковых клеток, поглощающих кислород с постоянной скоростью. Кровь, протекающая по кровеносному сосуду, непрерывно отдает его окружающим тканям, в результате чего содержание кислорода снижается вдоль сосуда по ходу тока крови. С другой стороны, кислород, диффундирующий от сосуда в толщу ткани, поглощается клетками, так что его напряжение (рО2) снижается по мере удаления от кровеносного сосуда. Там, где оно падает до 1-2 мм рт. ст. (т. е. практически до нуля), клетки оказываются в состоянии как бы полной аноксии. Во всем слое ткани ближе этой границы они не испытывают кислородного дискомфорта, т. е. находятся в состоянии нормоксии. Очевидно, что чем ниже было исходное содержание кислорода в данном участке сосуда, тем тоньше слой ткани, полностью «выедающей» весь кислород. Иначе говоря, по ходу тока крови толщина слоя клеток в состоянии нормоксии сужается, образуя тем самым конус из нормально обеспеченных кислородом клеток. Протяженность конуса увеличивается с ускорением тока крови, а ширина его уменьшается с увеличением потребления кислорода клетками.

Таким образом, подавляющее большинство клеток в ткани может находиться в каждый данный момент времени лишь в одном из двух крайних состояний: нормоксии или аноксии. В ткани часть клеток находится в состоянии нормоксии, а часть - аноксии. Доля клеток, которые лишены кислорода, от общего числа клеток в ткани может служить количественной характеристикой степени гипоксии в ткани.

Как кровоток, так и потребление кислорода клетками могут изменяться во времени, так что одна и та же клетка может в одни моменты быть в состоянии аноксии, а в другие - нормоксии. Тогда можно говорить и о степени гипоксии для данной клетки, имея в виду ту часть времени, которую данная клетка провела в условиях отсутствия кислорода.

Mитохондрии - главная мишень при гипоксическом повреждении клеток. Пребывание клеток в состоянии аноксии в течение 30-90 мин (для разных тканей) приводит к их повреждению, т.е. необратимому нарушению функций. Ученых давно волновал вопрос, какие структуры клеток при этом повреждаются первыми, предопределяя последующую гибель всей клетки. Накопленный к настоящему времени экспериментальный материал позволяет утверждать, что такими структурами являются биоэнергетические станции клетки - митохондрии.

При длительной гипоксии митохондрии в ткани повреждаются, о чем говорит снижение дыхательного контроля и кальцийаккумулирующей способности (емкости) митохондрии (рис.3).

Ионы кальция и активация фосфолипазы при аноксии. В опытах с изолированными митохондриями было показано, что при инкубации этих органелл происходит их быстрое повреждение (за 15-20 мин при 37 0С), если в окружающей их среде нет кислорода и присутствуют ионы кальция в концентрациях (порядка 10-5 М), соизмеримых с концентрацией этих ионов в цитоплазме клеток в условии гипоксии. Повреждение вызвано активацией ионами кальция фермента фосфолипазы А2, расположенного на внутренней мембране митохондрий. Фосфолипаза А2гидролизует сложноэфирные связи в молекуле фосфолипида, при этом образуются свободная жирная кислота (СЖК) и лизофосфолипид (ЛФ), например лизофосфатидилхолин при гидролизе фосфатидилхолина (лецитина):

 

Здесь R1, R2- углеводородные цепи жирных кислот.

Как известно, фосфолипазы присутствуют в пищеварительном соке поджелудочной железы, а также практически во всех мембранных структурах клетки, включая митохондрии, лизосомы, плазматические мембраны. В мембранах фосфолипазы обычно находятся в малоактивном состоянии, так как фосфолипазы активируются ионами кальция и ингибируются ионами магния, а в цитоплазме как раз мало кальция (10-7 Ми менее) и относительно много ионов Mg (около 10-3 М). Увеличение проницаемости плазматической мембраны при повреждении клетки или при открывании кальциевых каналов (т. е. возбуждении клетки), равно как и выключение ионных насосов за счет недостатка энергии в клетке, приводит к увеличению концентрации кальция в цитоплазме. Некоторое повышение его концентрации (до 10-6 М) следует считать нормальным механизмом регуляции внутриклеточных процессов, так как кальций является вторичным посредником при действии многих гормонов, медиаторов и при генерации потенциалов действия в ряде клеток. Умеренная активация фосфолипазы А2- также нормальное физиологическое явление, поскольку служит первым звеном в цепи образования физиологически активных производных арахидоновой кислоты. Чрезмерное увеличение концентрации ионов кальция в цитоплазме и активация фосфолипазы приводят к потере мембранами их барьерных свойств и нарушению функционирования клеточных органелл и клетки в целом.

В аэробных условиях ионов кальция вокруг митохондрий мало (10-7- 10-6 М) и фосфолипаза умеренно активна. В отсутствие кислорода исчезает электрический потенциал на мембране митохондрий, который удерживал ионы кальция в матриксе, и кальций выходит в цитоплазму. Связываясь с активным центром фосфолипазы А2(который как раз расположен с наружной стороны внутренней мембраны), ионы кальция активируют фермент. Гидролиз фосфолипидов приводит к потере мембраной ее барьерных свойств, и митохондрии теряют способность как к окислительному фосфорилированию, так и к закачиванию кальция в матрикс.

Последовательность нарушений в клетке при гипоксии. Последовательность изменений в клетке в результате прекращения доступа кислорода (аноксии) одинакова для самых различных тканей. Это показали опыты со срезами тканей, изолированными клетками и изолированными клеточными органеллами, в частности митохондриями. В клетках печени, находящихся в условиях аноксии при комнатной температуре, последова­тельность событий такова:

0-5 мин аноксии: снижение уровня АТФ в клетке в 2-4 раза, несмотря на активацию гликолиза;

5-15 мин: повышение концентрации Са2+в цитоплазме клетки. Активация гидролитических ферментов, в том числе фосфолипазы А2митохондрий. Содержание Са2+в митохондриях повышается, так как они еще не повреждены;

15-30 мин: гидролиз митохондриальных фосфолипидов фосфолипазой А2и нарушение барьерных свойств митохондриальной мембраны. Реоксигенация ткани на этой стадии приводит к активному набуханию митохондрий. Дыхательный контроль в митохондриях нарушен, окислительное фосфорилирование разобщено, способность митохондрий накапливать ионы кальция снижена;

30-60 мин: частичное восстановление функций митохондрий, временное повышение дыхательного контроля, способности накапливать кальций. Механизм компенсаторных процессов, приводящих к временному улучшению функций митохондрий, неизвестен, но связан с функцией клетки в целом, так как при анаэробной инкубации изолированных митохондрий это явление не наблюдается;

60-90 мин: необратимое повреждение митохондрий и полная гибель клеток. При температуре тела человека все эти процессы протекают в два-три раза быстрее; кроме того, в разных тканях они протекают с разной скоростью: быстрее всего в мозге, медленнее - в печени, еще медленнее - в мышцах.

 

3.1.5. «Порочный круг» клеточной патологии

Увеличение внутриклеточного содержания кальция и нарушение био­энергетических функций митохондрий являются общими признаками для клеток, поврежденных в результате действия самых различных неблаго­приятных факторов. Эти два события - не простое следствие других изменений в поврежденных клетках: они лежат в основе нарушения функций поврежденных клеток и могут рассматриваться как главные звенья в цепи событий, приводящих к развитию неспецифической реакции клеток на повреждение. Взаимоотношения между первичным повреждением клеточных структур, процессами биоэнергетики и содержанием кальция в цитоплазме представлены в виде схемы на рис.4.

Согласно этой схеме, первичными мишенями действия повреждающих агентов служат мембранные структуры клетки, в которых могут подвергаться разрушению липидный бислой, рецепторы, белковые переносчики ионов и молекул, ионные каналы, а также встроенные в мембраны ферменты, включая ионные насосы. Увеличение проницаемости мембран и подавление работы ионных насосов, непосредственно вызванные действием повреждающих факторов (токсические соединения, свободные радикалы и продукты липидной пероксидации, недостаток АТФ и т.д.), приводят к увеличению концентрации натрия и кальция в цитоплазме. Последнее сопровождается дисбалансом внутриклеточных сигнальных систем и активацией ряда ферментов, включая некоторые протеазы, эндонуклеазы и фосфолипазу А2. Гидролиз фосфолипидов мембран фосфолипазой приводит к дальнейшему нарушению барьерных свойств липидного бислоя, что вызывает еще больший рост уровня кальция в цитоплазме, набухание митохондрий и еще большее их повреждение. «Порочный круг» замыкается, и клетка может погибнуть.

 

3.1.6. Основные механизмы нарушения барьерной функции биологических мембран при патологии

Биологические мембраны выполняют множество функции, нарушение любой из которых может привести к изменению жизнедеятельности клетки в целом и даже к ее гибели. На рис. 5 дано схематическое изображение типичной мембраны с указанием тех ее элементов, повреждение которых может иметь место в патологии и лежать в основе развития различных заболеваний.

Наиболее тяжелые последствия вызывает повреждение липидного слоя (или бислоя)мембраны. Липидный слой цитоплазматической и внутриклеточных мембран выполняет две основные функции - барьерную и матричную (структурную). Повреждение барьера приводит к нарушению регуляции вну­триклеточных процессов и тяжелым расстройствам клеточных функций.

Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (например, эритроциты), митохондрии, фосфолипидные везикулы (липосомы), плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) и другие модельные объекты показало, что в конечном счете существует всего четыре основных процесса, которые непосредственно обусловливают нарушение целостности липидного бислоя в патологии [Владимиров Ю. А., 1973]:

1) перекисное окисление липидов;

2) действие мембранных фосфолипаз;

3) механическое (осмотическое) растяжение мембраны;

4) адсорбция на липидном слое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды.

Изучение роли мембран в развитии того или иного патологического состояния предполагает знание химических и физических условийпротекания перечисленных выше процессов и результата их действия на мембранные структуры, включая знание молекулярных механизмов действия каждого из них и биологические последствия повреждения мембран для жизнедеятельности клетки и организма в целом.

Механическое (осмотическое) растяжение мембран и адсорбция белков. Важную роль во вторичном повреждении мембран играют процессы их механического растяжения в результате нарушения осмотического равно­весия в клетках. Если поместить эритроциты в гипотонический раствор, то вода будет входить в клетки, они примут сферическую форму, а затем произойдет гемолиз. Митохондрии также набухают в гипотонических средах, но происходит разрыв только внешней мембраны; внутренняя остается целой, хотя теряет способность задерживать небольшие молекулы и ионы. В результате митохондрии не способны к окислительному фосфорилированию.

Сходные явления наблюдаются и в целых клетках и тканях в условиях патологии. Так, в результате активации фосфолипазы мембран митохондрий при гипоксии они становятся проницаемыми для ионов калия. Если в этих условиях восстановить оксигенацию ткани, то на мембранах митохондрий восстановится мембранный потенциал (со знаком «минус» внутри) и митохондрии будут «насасывать» ионы калия, вслед за которыми в матрикс входит фосфат. Концентрация ионов внутри митохондрий возрастает, и органеллы набухают. Это приводит к растяжению мембран и их дальнейшему повреждению.

Механизм нарушения барьерной функции мембраны при адсорбции на липидном бислое полиэлектролитов, в частности белков, чужеродных для клетки, пока изучен недостаточно. В модельных опытах показано, что в некоторых случаях в мембране могут формироваться белковые «поры», а также происходит снижение ее электрической стабильности. Можно думать, что сходные явления имеют место при действии на клетки антител.

Молекулярные механизмы увеличения проницаемости липидного слоя для ионов. При изучении молекулярных основ проницаемости липидного слоя широко используются модельные мембранные системы: изолированные мембранные структуры (эритроциты, митохондрии, везикулы саркоплазматического ретикулума), а также искусственные фосфолипидные мембраны (бимолекулярные липидные мембраны и фосфолипидные везикулы - липосомы). Изучение такого рода систем показало, что сам по себе липидный слой практически непроницаем для ионов. При действии различных химических и физических факторов он становится проницаемым по одной из трех причин (или их комбинаций):

1. В липидном бислое (вязкость которого внутри близка вязкости растительного масла) появляется жирорастворимое вещество, способное связывать ионы. Механизм переноса ионов в этом случае напоминает перевоз пассажиров в лодке с одного берега на другой и называется «челночным», или переносом с помощью подвижного переносчика. Примером подвижного переносчика может служить ионофорный антибиотик валиномицин, который образует комплекс с ионами калия, растворимый в липидной фазе мембраны. К числу подвижных переносчиков, возможно, относятся водорастворимые продукты перекисного окисления липидов, в присутствии которых, как оказалось, увеличивается проницаемость мембраны для ионов водорода.

2. В липидном слое появляются вещества, молекулы которых, собираясь вместе, образуютканал через мембрану. Сквозь такой канал ионы могут проходить с одной стороны мембраны на другую. Каналы образуются молекулами некоторых антибиотиков, например грамицидина А и полимиксина. Продукты перекисного окисления липидов также могут образовывать каналы в липидном слое, если в растворе есть ионы каль­ция. Продукты расщепления некоторых фосфолипидов (в частности, кардиолипина) фосфолипазой А2образуют каналы для одновалентных катионов.

3. Снижается электрическая прочность липидного слоя мембраны и ее участок разрушается электрическим током, который возникает под влиянием разности потенциалов, существующей на мембране. Такое явление носит название элект-рического пробоя.

 

Свободные радикалы и

Их роль в патологии

Хорошо известно, что в органических молекулах (включая те, из которых состоит наш организм) электроны на внешней электронной оболочке располагаются парами: одна пара на каждой орбитали. Свободные радикалы отличаются от обычных молекул тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный (одиночный) электрон. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул и тем самым их повреждая.

Неспаренный электрон в радикалах принято обозначать точкой. Например, радикал гидроксила обозначают как НО•, радикал перекиси водорода как НОО•, радикал супероксида как •ОО-или O2•. Ниже даны формулы трех радикалов этилового спирта:

 

СН3СН2О•; СН3CНОH; СН3СН2О•

 

Методы изучения свободных радикалов. Радикалы обладают высокой реакционной способностью и изучать их обычными химическими методами невозможно; стандартные процедуры вроде хроматографии или центрифугирования совершенно бесполезны.

Биохимические анализы позволяют, правда, определятьконечные продуктыреакций, в которых предполагается участие радикалов, но всегда остаются вопросы: а действительно ли радикалы участвовали в процессе и какие именно? Важную роль при решении таких вопросов играет так называемыйингибиторный анализ. Классическим примером может служить применение фермента супероксиддисмутазы (СОД). Этот фермент катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал и остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует (рис. 6).

Ингибиторный анализ используется и для изучения реакций с участием других радикалов. Так, для выяснения участия в каком-нибудь процессе реакций цепного окисления липидов (см. ниже) используют жирорастворимые «ловушки» липидных радикалов, которые «ведут» цепи окисления (рис. 7). К числу таких ловушек относятся токоферол (витамин Е) и некоторые синтетические соединения, например трет-бутилгидрокситолуол (ионол). Водорастворимые радикалы эффективно «перехватываются» аскорбиновой или мочевой кислотой. Для «улавливания» радикалов гидроксила (НО•) используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда - этанол. Однако далеко не всегда ловушки специфичны:многие из них реагируют не только с радикалами, но и с достаточно активными молекулами.

Прямым методом изучения свободных радикалов можно считать метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), позволяющий обнаруживать молекулярные частицы и ионы металлов, обладающие неспаренным электроном. По амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно определять концентрацию частиц с неспаренными электронами и судить об их строении.

К эффективным методам изучения реакций, идущих с участием радикалов, можно отнести метод хемилюминесценции (ХЛ). В основе его лежит то обстоятельство, что при взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая может испускаться в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакций, в которой участвуют радикалы, и, следовательно, показывает изменение их концентрации в ходе изучаемого процесса.

В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов, поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) обычно очень мала. Выход из положения заключается в использовании так называемых спиновых ловушек в методе ЭПР и активаторов свечения. В первом случае к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества - спиновые ловушки. Например, в качестве ловушки для радикалов гидроксила (•OH) используют фенилбутилнитрон (ФБН).

При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название спинового аддукта (от английского слова add - добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов (скажем, супероксида) используют другие ловушки.

 

3.1.7. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Все радикалы, образующиеся в организме человека, можно разделить на природные и чужеродные. В свою очередь природные радикалы можно разделить на первичные, вторичные и третичные (рис. 8).

Первичные радикалы - те радикалы, образование которых осуществляется при участии определенных ферментных систем. Прежде всего к ним относятся радикалы (семихиноны), образующиеся в реакциях таких переносчиков электронов, как коэнзим Q (обозначим радикал как Q•) и флавопротеины. Два других радикала - супероксид (•ОО-) и монооксид азота (•NO) также выполняют полезные для организма функции.

Из первичного радикала - супероксида, а также в результате других реакций в организме образуются весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, в первую очередь Fe2+, из этих веществ образуются вторичные радикалы (радикал гидроксила и радикалы липидов), которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры.

Для защиты от повреждающего действия вторичных радикалов в организме используется большая группа веществ, называемых антиоксидантами, к числу которых принадлежат ловушки, или пepexватчики свободных радикалов. Примером последних служат альфа-токоферол, тироксин, восстановленный убихинон (QН2) и женские стероидные гормоны. Реагируя с липидными радикалами, эти вещества сами превращаются в радикалы антиоксидантов, которые можно рассматривать как третичные радикалы.

Наряду с этими радикалами, постоянно образующимися в том или ином количестве в клетках и тканях организма человека, разрушительное действие могут оказывать радикалы, появляющиеся при таких воздействиях, как ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение или даже освещение интенсивным видимым светом, например светом лазера. Такие радикалы можно назвать чужеродными. К ним принадлежат также радикалы, образующиеся из попавших в организм посторонних соединений, ксенобиотиков, многие из которых оказывают токсическое действие именно благодаря свободным радикалам, образующимся при метаболизме этих соединений.

Радикалы кислорода. Клетки-фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови и тканевые клетки - макрофаги), соприкасаясь с поверхностью клеток, бактерий, начинают энергично выделять супероксид: радикалы, образующиеся в результате переноса электрона от НАДФН-оксидазного ферментного комплекса, встроенного в мембрану клеток и внутриклеточных везикул-фагосом, на растворенный молекулярный кислород

НАДФН + 2О=О ®

® НАДФ++ 2 (•ОО -) + Н+

(супероксид анион-радикал)

При этом каждая молекула НАДФН, окисляясь, отдает два электрона в цепь переноса электронов, а каждый из этих электронов присоединяется к молекуле кислорода, в результате чего образуется супероксид анион-радикал (рис. 9).

Супероксидные радикалы, как мы увидим позже, могут нанести вред как самим фагоцитам, так и другим клеткам крови и, разумеется, микробам, вызвавшим активацию макрофага. Естественно, что все эти клетки стараются избавиться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые супероксиддисмутазами. Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

супероксиддисмутаза

•ОО - + •ОО - + 2Н+®

® О2+ НООН (перекись водорода)

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Судьба последней может быть разной (рис. 10).

В норме фагоциты используют перекись водорода для синтеза гипохлорита, выделяя специальный фермент - миелопероксидазу (МП). Миелопероксидаза катализирует реакцию

миелопероксидаза

Н2О2+ Cl - ® Н2О + ClО -(гипохлорит)

Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и тем самым убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разрушается в результате активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы (GSH-пероксидазы), которые катализируют соответственно такие реакции:

каталаза

2Н2О2® 2Н2О + О2

 

глутатионпероксидаза

Н2О2+ 2GSH ® GSSG + 2Н2О

В присутствии ионов двухвалентного железа перекись водорода разлагается с образованием гидроксильного радикала (НО •):

Н2О2+ Fe2+® Fe3++ НО - + НО•

Эта реакция (известная как реакция Фентон) приводит к тяжелым последствиям для окружающих клеток. Радикал гидроксила чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу. Действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, НО • вызывает денатурацию последних и инактивирует ферменты. В нуклеиновых кислотах НО • разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и таким образом разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Внедряясь в липидный слой клеточных мембран, гидроксильный радикал запускает (инициирует) реакции цепного окисления липидов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и гибели клеток.

Гидроксильный радикал образуется не только в реакции Фентон, но и при взаимодействии ионов железа (Fe 2+) с гипохлоритом (реакция Осипова):

ClО -+ Fe2++ H+ ® Fe3++ Cl -+ НО•

Супероксидный радикал (• OO-)и продукты его метаболизма (H2O2, HO •, ClO-) называют активными формами кислорода.

Окись азота. К числу радикалов, синтезируемых клетками, относится монооксид азота •NO, называемый также нитроксидом. Нитроксид образуется клетками стенок кровеносных сосудов (эндотелия); эта реакция катализируется гемсодержащим ферментом NO -синтазой. •NO играет ключевую роль в регуляции тонуса сосудов и кровяного давления: его недостаток приводит к гипертензии, избыток - к гипотензии. Нарушение метаболизма фактора расслабления вызывает заболевания, связанные с изменением кровяного давления.

• NO выделяется также клетками-фагоцитами и вместе с супероксид-радикалами используется для борьбы с микробами (преимущественно грибковой природы). Полагают, что цитотоксическое действие • NO обусловлено его реакцией с супер-оксидом

•N = О + •ОО-+ Н+® ONOOH (пероксинитрит)

Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием • ОН:

О = N - О - ОН ® О = N - О•+ •OH (радикал гидроксила)

Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к повреждению клеток. По-видимому, одна из функций супероксиддисмутазысостоит в предотвращении образования пероксинитрита за счет удаления супероксида из зоны образования окиси азота.

Радикал коэнзима Q. Биологическое окисление субстратов клеточного дыхания, таких как глюкоза, пировиноградная и янтарная кислоты и другие, осуществляется, как известно, в два этапа. Нa первом этапе в цикле трикарбоновых кислот происходит последовательный отрыв атомов водорода от субстрата и образование восстановленных форм пиридиннуклеотидов НАДН и НАДФН. На втором этапе электроны от НАДН и НАДФН переносятся по так называемой дыхательной цепи на кислород. В состав дыхательной цепи входят флавопротеиды, комплексы негемового железа, убихинон и гемопротеиды (цитохромы а, b и с и цитохромоксидаза). Схема дыхательной цепи дана на рис. 11.

Важным звеном цепи переноса электронов служит убихинон (коэнзим Q):

 

радикал которого (семихинон, • QH на рис. 11) образуется либо при одноэлектронном окислении убихинона (QH2, гидрохинон-форма):

 

гидрохинон катион-радикал нейтральный гидрохинона радикал (семихинон)

либо при одноэлектронном восстановлении убихинона (Q на рис. 11):

 

хинон анион-радикал нейтральный

хинона радикал (семихинон)

 

В норме этот радикал является рядовым участником процесса переноса электронов, но при нарушении работы дыхательной цепи он может стать источником других, менее безобидных радикалов, в первую очередь радикалов кислорода.

Основные стадии цепного окисления. Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии. Она протекает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи (см. схему 3).

Инициирование цепной реакции начинается с того, что в липидный слой мембран или липопротеинов внедряется свободный радикал. Чаще всего это радикал гидроксила. Будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, он способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом образуются липидные радикалы:

НО•+ LH ® Н2О + L•

Липидный радикал (L•) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO•):

L•+ О2® LOO•

Этот радикал атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L •:

LOO•+ LH ® LOOН + L•

Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов (см. схему 3).

Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ с гидроперекисями липидов:

Fe2++ LOOН ® Fe3++ НО-+ LО•

Образующиеся радикалы LО • инициируют новые цепи окисления липидов (см. схему 3):

LО•+ LH ® LOН + L•; L•+ О2 ® LOO•® и т.д.

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом:

LOO•+ Fe2++ H+® LOOН + Fe3+

LOO•+ InH ® In•+ LOOH

LOO•+ LOO•® молекулярные продукты

Последняя реакция особенно интересна, поскольку она сопровождается свечением (хемилюминесценцией). Интенсивность этой хемилюминесценции очень мала, поэтому ее иногда называют «сверхслабым свечением». Интенсивность свечения пропорциональна квадрату концентрации свободных радикалов в мембранах, а скорость перекисного окисления прямо пропорциональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность «сверхслабого» свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале и измерение хемилюминесценции довольно часто используется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах.

Повреждающее действие пероксидации липидов. На рис.12 показаны основные мишени перекисного окисления липидов в мембранных структурах клеток. Повреждаются либо белковые структуры, либо липидный бислой в целом. В последнее время ученые уделяют все большее внимание взаимодействию мембран с нуклеиновыми кислотами в ядре и митохондриях. По-видимому, одним из результатов пероксидации липидов может стать повреждение этих молекул со всеми вытекающими последствиями.

Наиболее чувствительны к перекисному окислению липидов сульфгидрильные, или тиоловые, группы (- SH) мембранных белков: ферментов, ионных каналов и насосов. В ходе окисления тиоловых групп образуются радикалы (- S •), которые затем либо взаимодействуют друг с другом с образованием дисульфидов (- SS- ), либо связываются с кислородом с образованием сульфитов и сульфатов (- SО3и - SO4). Большую роль в патологии клетки играет также повреждение ионтранспортирующих ферментов (например, Ca2+, Mg2+-АТФазы), в активный центр которых входят тиоловые группы (рис. 12-1). Инактивация Са2+-АТФазы приводит к замедлению откачивания из клетки ионов кальция и ускорению их «протечки» в клетку (где их концентрация меньше). Это вызывает рост уровня ионов кальция в цитоплазме и повреждение клеточных структур.

Окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в мембранах клеток и митохондрий. Под действием электрического поля через такие дефекты в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембранных структур.

Еще одним интересным примером может служить окисление белков и последующее образование белковых агрегатов в хрусталике глаза, вызванное пероксидацией липидов. Процесс приводит к помутнению хрусталика и может считаться одной из причин развития старческой и других видов катаракты у человека.

Наряду с белками и нуклеиновыми кислотами мишенью повреждающего действия перекисного окисления служит са