Работа 2. Изучение проницаемости плазмалеммы и тонопласта

Цель: изучить влияние различных факторов на проницаемость цитоплазмы

Объекты, реактивы, оборудование: луковицы бесцветного и синего лука, 1 М растворы сахарозы и КNО₃, 0,5% индигокармин, 0,01 % нейтральный красный, 1 М растворы КNО₃ и сахарозы с эозином, 10% глицерин; пинцеты, препаровальные иглы, предметные и покровные стекла, кусочки фильтровальной бумаги, стаканчики с водой, пипетки глазные, микроскопы.

Краткие сведения

 

Биомембрана обладает избирательной проницаемостью. Избирательная проницаемость — способность мембраны пропускать различные вещества с неодинаковой скоростью. Избирательная прони­цаемость свойственна только живым мембранам. При высокой температуре, действии кислот, щелочей, растворителей липидов, вследствие коагуляции белковых компонентов мембран или вымывания их липидного матрикса она теряет это свойство и беспрепятственно пропускает вещества. Проницаемость мембраны увеличивается при повышении температуры и освещения, при водном дефиците, а также при старении клетки — в результате нарушения естественной структуры мембран.

Установлено, что краска нейтральный красный проникает в живую клетку и накапливается там в значительном количестве. Однако цитоплазма живой клетки имеет слабое сродство к красителю. Одной из причин аккумуляции нейтрального красного в вакуолях живых клеток связана с разностью рН между цитоплазмой и вакуолярным соком. Нейтральный красный накапливается в «кислом компартменте» клетки, так как сам является слабым основанием. Окрашивание цитоплазмы и ядра – признак повреждения клетки. В то же время живая цитоплазма непроницаема для индигокармина и кислого фуксина. На окрашивании этими красителями основано определение жизнеспособности тканей клубней, семян и их зародышей и т.д. Имеется разница в проницаемости пограничных мембран цитоплазмы ^__ плазмалеммы и тонопласта ^__ для одних и тех же веществ.

Ионы К⁺ сравнительно хорошо проникают через плазмалемму и значительно хуже через тонопласт. Накапливаясь в цитоплазме, калий увеличивает ее оводненность, вследствие чего она набухает и приобретает вид колпачков, хорошо различимых на концах плазмолизированного протопласта (колпачковый плазмолиз).

Колпачковый плазмолиз можно наблюдать при использовании гипертонического раствора какой-нибудь калиевой соли, чаще всего нитрата калия. Цитоплазма, обычно покрывающая тонким слоем вакуоль, при набухании становится хорошо видимой. Это позволяет определить локализацию красителя в клетке. Если краситель накапливается в вакуоли, то колпачки цитоплазмы сероватого цвета. В случае накопления красителя в цитоплазме она окрашивается более интенсивно, чем вакуоль. Появление «колпачков» обусловлено разжижающим действием ионов калия, которые относительно быстро проходят через плазмалемму в протопласт, накапливаясь в мезоплазме, и гораздо медленнее проникают из протопласта в вакуоль.

 

Рис. 1. Колпачковый плазмолиз. 1 – набухшая протоплазма, образовавшая колпачки; 2 – ядро; 3 – вакуоля с окрашенным клеточным соком.

 

 

Ход работы

Обнаружение проницаемости пограничных слоев цитоплазмы по отношению к тем или иным веществам основано на выдерживании ткани в соответствующих растворах в течение определенного времени с последующим микроскопированием для выявления локализации этих веществ в клетке. Изучение проницаемости тонопласта и плазмалеммы для разных соединений требует специальных методических приемов. Поэтому они рассматриваются конкретно в каждой задаче.

Задача. Изучить проницаемость пограничных мембран цитоплазмы:

 

1) для нейтрального красного. Несколько кусочков бесцветного эпидермиса вогнутой стороны луковичной чешуи поместить на два предметных стекла в каплю воды. Убить клетки на одном из стекол, проведя его несколько раз над пламенем спиртовки. Фильтровальной бумагой убрать воду с обоих стекол и нанести на них по капле 0,02% раствора нейтрального красного. Через 10 мин убрать краситель, отмыть ткань водой с помощью пипетки, убрать остатки воды, капнуть на стекло 1 М раствор КNО₃. Через 20—30 мин просмотреть клетки под микроскопом. Отметить, одинаковая ли окраска ткани на стеклах, наблюдается ли плазмолиз, какая часть клетки (вакуоль, цитоплазма) окрасилась красителем. (Следует иметь в виду, что среди клеток эпидермиса лука, не подвергавшихся нагреванию, также могут быть нежизнеспособные клетки). Результаты записать по образцу табл. 1.

 

Таблица 1

Общий вид клетки (рисунок)
без нагревания	с нагреванием

2) для индигокармина. Обработать ткань, как указано в задаче 1. Нанести на два стекла по капле 0,05% раствора индигокармина. Через 20 мин убрать краситель кусочком фильтровальной бумаги и отмыть ткань. Нанести на стекла по капле 1 М раствора КNО₃. Через 20—30 мин просмотреть клетки под микроскопом. Сравнить окраску убитой и живой ткани. Отметить, какая часть клетки (цитоплазма, вакуоль) окрасилась красителем, имеется ли плазмолиз. Результаты записать в табл. 2 (аналогичной таблице 1). Сделать вывод о проницаемости пограничных мембран цитоплазмы живой и убитой клетки для индигокармина.

 

3) для ионов калия. Кусочки эпидермиса выпуклой стороны мясистой чешуи синего лука поместить на предметные стекла в 1 М растворы сахарозы и КNО₃. Через 30—40 мин просмотреть клетки под микроскопом. В варианте с сахарозой вакуоль окружена тонким слоем цитоплазмы, тогда как в КNО₃ слой цитоплазмы, особенно со стороны поперечных стенок, приобретет значительную толщину в виде «колпачков». Требуется объяснить наблюдаемое явление, а результаты (рисунок клетки) записать по форме табл. 3

 

Таблица 3

Действующее вещество	1 М сахароза	1 М КNО3.	1М сахароза + 1 М КNО3.
Общий вид клетки (рисунок)

 

4) для эозина. Кусочки эпидермиса вогнутой стороны чешуи бесцветного лука поместить на предметные стекла в 1 М растворы сахарозы + эозин и КNО₃ с эозином. Через 30 мин просмотреть клетки под микроскопом. Отметить появление колпачкового плазмолиза, окраску вакуоли и цитоплазмы на обоих стеклах. Результаты записать по форме табл. 4;

 

 

Таблица 4

Действующее вещество	1 М сахароза + эозин	1 М КNО3 + эозин
Общий вид клетки (рисунок)

 

Общие результаты работы записать по образцу табл. 5.

 

Таблица 5

Действующее вещество	Нейтральный красный	Индигокармин	Эозин	К+
Плазмалемма Тонопласт

 

Отметить наличие проницаемости пограничных мембран цитоплазмы для вещества знаком «+», а отсутствие ^___ знаком «^___».

Сделать выводы о характере проницаемости пограничных слоев цитоплазмы к различным веществам.