Работа 6. Определение потенциального осмотического давления клеточного сока методом плазмолиза

 

Цель: определить осмотическое давление клеточного сока синего лука плазмолитическим методом.

Объекты, реактивы, оборудование: Луковица синего лука с чешуями, 1М раствор сахарозы или KNO₃, безопасные бритвы, микроскопы, предметные и покровные стекла, бюксы, градуированные пипетки на 10 мл, препаровальные иглы, часы, фильтровальная бумага, термометр.

Краткие сведения

Клеточный сок — водный раствор различных органических и неорганических веществ. Потенциальное осмотическое давление зависит от числа частиц, находящихся в этом растворе, т. е. от концентрации и степени диссоциации растворенных молекул. Потенциальное осмотическое давление выражает максимальную способность клетки всасывать воду. Величина этого показателя указывает на возможность растения произрастать на почвах различной водоудерживающей силы. Повышение осмотического давления при засухе служит критерием обезвоживания растений и необходимости полива.

Данный метод основан на подборе такой концентрации наружного раствора, которая вызывает самый начальный (уголковый) плазмолиз в клетках исследуемой ткани. В этом случае осмотическое давление раствора примерно равно осмотическому давлению клеточного сока. Такой наружный раствор называют изотоническим.

Ход работы

В бюксах готовят по 10 мл растворов согласно форме таблицы 1. Для опыта можно взять сахарозу 1 М (или KNO₃) и с помощью разбавления дистиллированной водой получить нужную концентрацию. Растворы тщательно перемешивают, бюксы закрывают крышками, чтобы предотвратить испарение, и ставят в ряд по убывающей концентрации.

Лезвием безопасной бритвы делают тонкие срезы с выпуклой поверхности пигментированной чешуи луковицы размером примерно 25 мм² из среднего хорошо окрашенного участка.

В каждый бюкс, начиная с высокой концентрации, с интервалом 3 мин опускают по два-три среза. Через 30 мин после погружения срезов в первый бюкс их исследуют под микроскопом. Затем через каждые 3 мин наблюдают срезы из последующих бюксов. Таким способом достигают равную продолжительность пребывания срезов в растворах плазмолитиков. Срезы рассматривают под микроскопом в капле раствора из того бюкса, откуда они были взяты.

Определяют стадию плазмолиза (см. рис. 1 работы 1) клеток в каждом растворе и находят изотоническую концентрацию как среднюю арифметическую между концентрацией, при которой плазмолиз только начинался, и концентрацией, которая уже не вызывает плазмолиза.

Результаты опыта записывают в таблицу 1 по приведенной форме.

 

 

Таблица 1

Концентрация раствора, моль/л	На 10 мл раствора	Стадия плазмолиза	Изотоническая концентрация, моль/л	Потенциальное осмотическое давление, кПа
1М раствора сахарозы или КNO3, мл	Воды, мл
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1

 

Потенциальное осмотическое давление

Π = RcTi, где R – универсальная газовая постоянная, равная 8,314 Дж/моль▪К; Т- абсолютная температура в Кельвинах; с- изотоническая концентрация, М; i- изотонический коэффициент Вант-Гоффа.

Коэффициент Вант-Гоффа характеризует ионизацию растворов: I = 1+ α(n-1),
где α – степень диссоциации раствора данной концентрации, n – число ионов, на которое диссоциирует соль.

Так как неэлектролиты не диссоциируют, для сахарозы i= 1.

Степень диссоциации KNO₃ разной концентрации приведена ниже.

 

Концентрация	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Степень	0,71	0,74	0,76	0,79	0,83

 

В зависимости от вязкости цитоплазмы в клетках чешуи репчатого лука осмотическое давление варьирует, как правило, от 300 до 1300 кПа.

Определить осмотическое давление в клетках синего лука при комнатной температуре (20⁰С) и при температуре 4 ⁰С.

Работа 7. Определение сосущей силы (водного потенциала) тканей растений по изменению их размеров (метод Уршпрунга)

Цель: определить сосущую силу, тургорное и осмотическое давление растительных тканей

Объекты, реактивы, оборудование: свежие и подвявшие клубни картофеля, корнеплоды сахарной или столовой свеклы; молярные растворы сахарозы от 0,1 до 0,9 М, алюминиевые бюксы, разделочная доска, ножи, лезвия, пинцеты, линейки.

Краткие сведения

Сила, с которой клетка в данный момент поглощает воду, называется сосущей. Сосущая сила клетки зависит от ее физиологического состояния и от внешних условий. В покоящихся семенах и меристематических клетках она обусловлена главным образом давлением набухания коллоидов протоплазмы и пектиновых веществ клеточных оболочек. В клетках, закончивших рост и имеющих большую центральную вакуоль, сосущая сила в значительной степени определяется величиной осмотического давления клеточного сока π и тургорного давления Р, которое в свою очередь зависит от эластичности клеточной оболочки и содержания воды в клетке.

Осмотическое давление окружающего раствора (π) равно: π = iСRТ. Сосущая сила клетки обычно равна разности осмотического давления клеточного сока и тургорного давления: S кл. = π кл.сока ^__ Р. В зависимости от насыщения клетки водой величина тургорного давления будет меняться, соответственно изменится и сосущая сила клетки.

Водообмен между клеткой и окружающей средой определяется соотношением сосущей силы клетки и осмотическим давлением наружного раствора. Поглощение или отдача воды клетками сопровождается изменением как их размеров и веса, так и концентрации окружающего раствора. При погружении кусочка ткани растения в раствор с большим осмотическим давлением вода из клеток поступает в раствор и размеры кусочка уменьшаются (Р=0, следовательно, S = π). Если сосущая сила клеток выше, чем π окружающего раствора, клетки всасывают воду и кусочек ткани увеличивается. При равенстве сосущей силы ткани и π окружающего раствора между выходом и поступлением воды в клетку устанавливается равновесие и размеры кусочка ткани не изменяются.

Задача настоящей работы сводится к тому, чтобы из серии растворов найти такой, осмотическое давление которого равнялась бы сосущей силе клеток ткани. Зная, что S кл. = π р-ра, находим π р-ра. Осмотическое давление раствора (π р-ра) легко рассчитать, зная его молярную концентрацию.

Однако в настоящее время для характеристики энергетического уровня молекул воды (их способности диффундировать или испаряться) используется термодинамический показатель – водный потенциал, который для чистой воды принят за нуль (Ψ_Н2О = 0), а для любого раствора – меньше нуля. При замене осмотических показателей растительной клети (Sкл =π_{кл.сока} ^__ Р) термодинамическими вышеприведенное уравнение примет следующий вид:

 

— Ψ _Н2Окл = — Ψ_п + Ψ_р,

 

где Ψ_Н2Окл – водный потенциал клетки; Ψ_п – осмотический потенциал клеточного сока; Ψ_р – гидростатический потенциал.

Из уравнения видно, что осмотический потенциал понижает водный потенциал клетки, а потенциал давления повышает его. Как правило, Ψ_Н2О клетки отрицателен, и лишь при полном насыщении клетки водой, когда Ψ_р = Ψ_п, этот показатель равен нулю.

При погружении растительной клетки в какой-либо раствор водообмен между ними определяется соотношением их водных потенциалов: вода перемещается в сторону более отрицательного водного потенциала.

Ход работы

 

Поставить бюксы с растворами сахарозы указанной молярности на лабораторный стол. Вырезать из клубня или корнеплода (поперек продольной оси органа) пластинку толщиной 3-4 мм в форме прямоугольника размером 30х40 мм. С помощью лезвия и линейки разрезать ее на ряд одинаковых полосок величиной 3х40мм (нарезать полоски следует быстро, не допуская подвядания). Излишки клеточного сока, вытекающие при разрезании ткани, удалить фильтровальной бумагой. Погрузить по 3 полоски в растворы сахарозы (погружение должно быть полным). Через 30 мин извлечь полоски из растворов и измерить. Данные повторностей и средние из них записать по образцу в табл. 1.

Таблица 1

Концентрация сахарозы, М	0,9	0,7	0,5	0,3	0,2	0,1
Длина полосок, мм	Исходная (lu)
через 30 мин (l0)	Повтор- ность
В среднем
Разность до и после погружения в раствор (∆l),мм
∆l, %

На основании измерений рассчитывают % изменения длины полосок в каждом растворе по формуле:

 

∆

Данные заносят в таблицу. Используя их, строят график зависимости изменения длины полосок в % от концентрации наружного раствора. На оси абсцисс откладывают концентрации (С) приготовленных растворов, а на оси ординат — ∆l, %.

Объяснить причину изменения длины полосок в растворах разных концентраций. На основании графика выяснить следующие концентрации растворов, где клетки находятся: в состоянии полного тургора, частичного тургора, его отсутствия. Отмечают гипертонические, гипотонические и изотоническую концентрацию наружного раствора по отношению к концентрации клеточного сока растительной ткани.

Для определения величины сосущей силы клеток растительной ткани исходят из того, что в изотоническом растворе величина сосущей силы клеток равна осмотическому давлению наружного раствора, которое определяется по уравнению Вант-Гоффа π = iСRТ.

Определить раствор, сосущая сила которого равна сосущей силе данной ткани.

Рассчитать сосущую силу ткани по сосущей силе раствора.

Исходя из полученных результатов работы, вычертить диаграмму, отражающую зависимость между осмотическим давлением, водным потенциалом (сосущей силой) и тургорным давлением ткани. Для этого необходимо заполнить табл. 2.

 

 

Таблица 2

 

Концентрация сахарозы, М	L (длина полосок ткани через 30 мин), мм	S (сосущая сила клеток), Па S=сRT	π (осмотическое давление клеточного сока), Па	Р = π – S (тургорное давление),Па
0,9 0,7 0,5 0,3 0,2 0,1

В 1-ую графу записывается молярная концентрация использованных растворов сахарозы.

Во 2-ую ^__ длина полосок ткани после их 30-минутного пребывания в соответствующем растворе.

В 3-ю ^__ значение сосущей силы ткани в соответствующем растворе. Поскольку полоски находились в растворах достаточно продолжительное время и размеры их перестали меняться, то можно считать, что сосущая сила их уравнялась с осмотическим давлением окружающего раствора, т.е. S тк. = π р-ра; π р-ра легко вычислить по формуле π = iСRТ.

В 4-ую графу вносятся значения π клеточного сока. Принимаем, что для самой короткой полоски Р = 0, тогда, исходя из формулы S = π – Р, π₁ = S_1, В растворах меньшей концентрации полоски ткани будут иметь более низкие значения π, которые уменьшаются обратно пропорционально длине полосок ткани:

 

π·L₁ = π_n ^. L_n, значит π_n = π L₁/ L_n

 

Имея все значения S и π, можно заполнить последнюю графу таблицы, рассчитав значения Р для исследованных полосок ткани по формуле

 

π = Р — S

 

 

Далее необходимо вычертить диаграмму (рис.1).

На оси абсцисс в масштабе 1см: 1мм откладывают значения длины полосок ткани в порядке возрастания; на оси ординат ^___ значения π, затем Р для соответствующих полосок. Откладывать значения S нет необходимости, так как на графике они представляют отрезки π_n ^__ Р_n. Соединив точки π и Р линиями, получим график зависимости π, S и Р. На основании этого требуется сделать вывод о взаимной зависимости трех величин и объяснить, от какого показателя, π или Р зависит в основном изменение сосущей силы отрезков ткани.

 

Р4

Р5

Р3

Р2

π1 π2 π3 π4 π5

Рис. 1. Диаграмма зависимости между сосущей силой, осмотическим и тургорным давлением растительных клеток, по-разному насыщенных водой.