Работа 2. Разделение пигментов листа хроматографическим методом

Цель: разделить пигменты методом восходящей бумажной хроматографии

Объекты, реактивы, оборудование: свежие листья различных растений; ацетон, этанол, бензин или петролейный эфир (t.кип. 40-60⁰), мел в порошке или углекислый кальций, кварцевый песок или толченое стекло, дистиллированная вода; фарфоровые ступки с пестиком, пипетки, скальпели, стеклянные стаканчики, пробирки или цилиндры с пробками (для хроматографии), штатив для пробирок, пробочные сверла диаметром 0,8-1см, чашки Петри, хроматографическая и фильтровальная бумага, стеклянные палочки.

 

 

Краткие сведения

 

В составе фотосинтетических пигментов листа имеются два хлорофилла а и в и желтые пигменты ^__ каротиноиды, которые в соответствии с их химическим строением разделяются на две группы: каротины и более окисленные ксантофиллы. Те и другие представляют смесь нескольких пигментов близкого строения, которую можно разделить на отдельные компоненты с помощью метода хроматографии. Этот метод предложен русским ученым М.С.Цветом в 1906 г. и сейчас широко используется.

Все хроматографические системы состоят в основном из двух фаз: неподвижной и подвижной. Обычно подвижная фаза перемещается по неподвижной или пропускается через нее. Хроматографическое разделение смеси веществ может идти при следующих условиях: адсорбционного равновесия между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами (адсорбционная хроматография); равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной жидкой фазами (хроматография на бумаге); равномерного распределения между неподвижной жидкой и подвижной газовой фазами (газожидкостная хроматография); ионообменного равновесия между ионообменной смолой (неподвижная фаза) и электролитами (ионообменная хроматография); равновесного связывания макромолекулы с малой молекулой, по отношению к которой проявляет сродство (аффинная хроматография).

Метод хроматографии основан на различной подвижности (Rf) каждого компонента на определенном адсорбенте. Адсорбент – твердое вещество, способное удерживать на своей поверхности молекулы. В качестве адсорбентов могут быть использованы сахароза, окись магния, крахмал, силикагель, бумага и т.д. Подвижность вещества зависит от его растворимости в растворителе, пропускаемом через адсорбент, и адсорбируемости на данном адсорбенте. Чем выше растворимость пигмента в растворителе и чем хуже он адсорбируется на адсорбенте, тем больше его подвижность, тем дальше он будет расположен от стартовой полосы. Применяя разные комбинации растворителей и адсорбенты различной природы, можно добиться высокой степени разделения и очистки пигментов.

Одним из адсорбентов при хроматографии является бумага. Хроматографирование на бумаге выполняют восходящим и нисходящим способами. При восходящей хроматографии бумажную полосу подвешивают вертикально; при этом нижний ее конец, на который нанесена смесь пигментов, погружают в растворитель. По мере движения растворителя под действием капиллярных сил вертикально вверх происходит разделение растворенных веществ.

При нисходящей хроматографии верхний конец бумажной полосы со смесью пигментов, нанесенных недалеко от кромки бумаги, закрепляют в лотке, который размещают в верхней части камеры. Нижний конец бумаги располагается так, чтобы он не касался налитого на дно камеры растворителя. В результате действия капиллярных сил и силы тяжести растворитель начинает передвигаться вниз по бумажной полосе, в результате чего смесь разделяется.

Хроматографирование выполняют в герметично закрытых сосудах, где поддерживают насыщенную парами растворителей атмосферу, что предотвращает их испарение с бумаги. Для эффективного разделения пигментов бумага должна быть равномерной толщины и достаточно плотной.

В зависимости от цели исследования применяют одномерные и двумерные хроматограммы. В первом случае определяют либо хлорофиллы, либо каротиноиды. Если необходимо полное разделение смеси пигментов на отдельные компоненты, применяют двухмерную хроматограмму. В этом случае последовательно разгоняют пигменты на бумаге сначала в одном направлении, а затем в направлении, перпендикулярном первому.

Задача этой работы ^__ разделение полученного из листа экстракта на отдельные пигменты.

Ход работы

 

1. На полоску хроматографической или фильтровальной бумаге (2х12см) карандашом нанести стартовую линию (от края полоски 1-1,5 см), погрузить этим концом в вытяжку пигмента на глубину 1-1,5 см, затем высушить на воздухе. Операцию повторить 3-4 раза, до тех пор пока зона погружения не приобретет достаточно зеленый цвет. Далее опустить этот конец несколько раз в чистый ацетон на глубину 2 мм, согнать все пигменты в стартовую полосу (ширина 2-3 мм), просушить и вставить противоположным концом в разрез пробки. Закрыть пробкой пробирку, на дно которой налит бензин или петролейный эфир.

 

 

Полоска бумаги должна находиться в вертикальном положении, а ее нижний край надо погрузить в растворитель так, чтобы последний не касался стартовой полосы (рис. 1, а). До и после погружения хроматограммы пробирка должна быть закрыта плотно пробкой и находиться на слабом свету во избежания фоторазрушения пигментов. Когда растворитель достигнет верхнего края хроматограммы, полоску бумаги вынуть и просушить на воздухе. На хроматограмме отметить положение полос, соответствующих определенным пигментам.

2. На лист фильтровальной или хроматографической бумаги (15х15см) нанести пипеткой с оттянутым концом полосу пигментов на расстоянии 1,5 см от края. Ширина полосы должна быть около 1см, цвет ^__ интенсивнозеленый. Хроматограмму свернуть трубочкой, сколоть скрепкой и опустить нижним концом в банку, на дно которой налит слой бензина высотой около 1 см (рис.1, б). Стартовая полоса не должна касаться бензина. Если разделение пигментов происходит медленно и нечетко, следует вынуть хроматограмму и добавить к бензину 1-2 мл какого-либо полярного растворителя (спирт, ацетон). Снова погрузить в смесь хроматограмму и плотно закрыть крышкой. Когда пигмент, движущийся с фронтом растворителя, поднимется до верхнего края хроматограммы, ее вынимают, просушивают на воздухе и отмечают положение полос пигментов.

3. На круглом обеззоленном химическом фильтре сделать по радиусу 2 надреза, не доходя до центра, и полученный «язычок» немного отогнуть вниз. В центр с помощью пипетки нанести стартовое пятно пигментов и следить, чтобы оно не расплывалось. Пятно должно иметь интенсивно зеленый цвет, что достигается 2-3 кратным нанесением вытяжки. Затем просушить хроматограмму, положить ее на края чашки Петри, куда налит слой бензина (0,5 см), опустить «язычок» в растворитель и плотно закрыть чашку крышкой. На хроматограмме пигменты будут расположены концентрическими кругами со стартовым пятном в центре (рис. 1 в).

На хроматограммах, полученных каждым из трех способов, пигменты располагаются в одинаковом порядке. Слабо-зеленая зона, которая иногда и наблюдается на месте стартовой полосы или пятна, представляет собой хлорофиллид – бесфитольное производное хлорофилла, нерастворимое в бензине. Непосредственно над стартовой полосой находится хлорофилл б желтовато-зеленого цвета, над ним ^__ хлорофилл а голубовато-зеленого цвета. Далее следуют ксантофиллы, не разделяющиеся на отдельные компоненты при данном способе хроматографии, а затем с фронтом растворителя ^__ каротины.

Отдельным группам провести хроматографию пигментов по одному из указанных способов. На полученных хроматограммах отметить зоны расположения пигментов, обозначить их цифрами и слегка подкрасить в соответствующий цвет, так как на воздухе они быстро выцветают. Вклеить хроматограмму в лабораторную тетрадь. Стрелкой указать направление движения растворителя. Объяснить расположение пигментов на хроматограмме исходя из их химического строения и растворимости. Сделать вывод, какие пигменты можно выделить с помощью данного метода хроматографии и какой из способов пригоден для демонстрации состава пигментов листа в средней школе.

Подписать и расшифровать хроматограмму. В рабочей тетради зарисовать все способы хроматографического распределения пигментов.