Работа 5. Определение содержания основных пигментов фотосинтетического аппарата в листьях высших растений

Цель: определить спектрофотометрически количественное содержание хлорофиллов а и b, каротиноидов в исследуемом материале. Рассчитать соотношение хлорофилл а/хлоро­филл b. Показать адаптацию пигментного аппарата растений к световому режиму окружающей среды.

Объекты, реактивы, оборудование: листья растений разных световых экотипов; листья или хвоя одного и того же растения, растущие при разном световом режиме (листья внутри кроны, на верхушке побегов и т. д.); листья разного возраста; 96%-й раствор этилового спирта или 80%-й раствор ацетона; МgСО₃ (СаСОз); кварцевый песок; фарфоровые ступки с пестиками; скальпель; ножницы; пинцет; стеклянные палочки: колба Бунзена со стеклянным фильтром № 3; мерные колбы объемом 25 мл; мерный цилиндр объемом 25 мл; стеклянные воронки; конические пробирки; пипет­ки объемом 2 и 5 мл; фольга; весы торсионные, спектрофотометр.

 

Краткие сведения

Для извлечения пигментов из растительных тканей и их разделения обычно используют полярные растворители или смесь полярных (спирт, ацетон) и неполярных (петролейный эфир, гексан, бензин) растворителей. Так как пигменты быстро выцветают на свету, их экстракцию проводят в затемненном помещении с предварительно охлажденными растворителями. Чтобы предотвратить изомеризацию пигментов, экстракцию следует осуществлять возможно быстрее. Пигменты извлекают последовательно несколькими порциями растворителя, фильт­руя каждый раз раствор через стеклянный фильтр. При расти­рании листьев добавляют небольшое количество МgСОз или СаСО₃ для нейтрализации кислот клеточного сока и предот­вращения феофитинизации пигментов.

Количественное определение пигментов основано на их спо­собности поглощать лучи определенной длины волны. Реги­страцию оптической плотности раствора пигментов проводят на спектрофотометре. Определение концентрации хлорофиллов а и bв растворе без их разделения затруднено, так как спектры обоих хлорофиллов сильно перекрываются, и невозможно найти две длины волны, в которых поглощение обусловливалось бы полностью одним пигментом. Однако имеющиеся различия в спектрах поглощения хлорофиллов а и b позволяют выбрать точки, где поглощение одного пигмента заметно превышает поглощение другого. Это обстоятельство и используют при проведении количественного определения обоих хлорофиллов без их разделения.

В зависимости от природы растворителя, используемого для извлечения пигментов, их концентрации рассчитывают по сле­дующим формулам (С — концентрация, D— оптическая плотность):

 

1) в 80% -м растворе ацетона (Vernon, 1960):

С_хла, мг/л = 11,63▪D₆₆₅ — 2.39▪D₆₄₉,

C_хлb, мг/л = 20,11▪ D₆₄₉ — 5,18▪D₆₆₅,

С_{хла +хлb}, мг/л = 6,45 ▪D₆₆₅ — 17,72▪D₆₄₉;

2) в 100% -м растворе ацетона (Wettstein, 1957):

С_хла, мг/л = 9, 784 ▪D₆₆₂ — 0,990▪ D₆₄₄,

С_хлb, мг/л = 21,426 ▪D₆₄₄ — 4,650▪ D₆₆₂,

С_{хла +хлb}, мг/л = 5, 134 ▪D₆₆₂ + 20,436▪ D₆₄₄,

C_кар, мг/л = 4,695 ▪D_440,5 — 0,268 ▪С_{хла +хлb;}

3) 96-м растворе спирта (Wintermans, de Mots, 1965):

С_хла, мг/л = 13,70▪D₆₆₅ — 5,76▪D₆₄₉,

С_хлb, мг/л = 25,80▪D₆₄₉ — 7,60 ▪D₆₆₅,

С_{хла +хлb}, мг/л = 6,10▪D₆₆₅ + 20,04▪D₆₄₉ = 25,1▪▪D₆₅₄;

4) в 80%-м растворе ацетона (Lichtenthaler et al., 1982):

С_хла, мг/л = 12,21▪D₆₆₃ — 2,81 ▪D₆₄₆,

С_хлb, мг/л = 20,13▪ D₆₄₆ — 5,03 ▪D₆₆₃,

 

1000D470 — 3, 27Схла — 100 Схлb,

Cкар, мг/л = 229

 

где С_хла, С_хлb, С_хла+хлb и С_кар — соответственно концентрации хлорофиллов а, b их суммы и каратиноидов, мг/л; D — экспериментально полученные величины оптической плотности при соответствующих длинах волн.

Ход работы

Для решения задачи необходимо провести экстракцию пигментов и определить на спектрофотометре их концентрацию. Навеску растительного материала (100—200 мг) размельчают ножницами, помещают в маленькую ступку, добавляют на кончике скальпеля немного МgСОз, приливают 4—5мл ацетона и тщательно растирают. Полученную вытяжку сливают по палочке на стеклянный фильтр, вставленный в колбу Бунзена. При помощи насоса жидкость отсасывают. По­сле этого в ступку приливают еще немного ацетона, растирают, снова вливают на фильтр и отсасывают. Эту операцию повто­ряют несколько раз, пока раствор, стекающий из фильтра, не будет абсолютно бесцветным.

Вытяжку переливают в мерную колбу, колбу Бунзена ополаскивают несколько раз небольшими порциями ацетона и до­водят чистым ацетоном объем вытяжки в мерной колбе до метки. Работа количественная, нельзя терять ни одной капли! Полученная ацетоновая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

Концентрацию хлорофиллов а и b определяют на спектрофотометре. Для этого часть полученного экстракта наливают в кювету спектрофотометра. Вторую кювету, заполненную чи­стым растворителем, используют как контрольную. Кюветы помещают в кюветную камеру спектро­фотометра и определяют оптическую плотность D вытяжки при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов а и bв 80%-м растворе ацетона, 663 и 646 нм. Для определения содержания каротиноидов определяют оптическую плотность D вытяжки при λ=470 нм.

Затем вычисляют содержание пигментов А в растительном материале, мг/г сырой массы:

А = VС/1000P,

где С — концентрация пигментов, мг/л; V — объем вытяжки,мл (25 мл); Р — навеска растительного материала, г (0,1 — 0,2 г).

Результаты измерений занести в таблицу 1.

 

Таблица 1

Объект исследования	Масса навески, мг	Оптическая плотность (D) при длине волны

 

Результаты расчетов записать в таблицу по следующей форме таблицы 2.

 

Таблица 2

Объект исследования	Количество пигментов, мг/л раствора	Количество пигментов в сыром листе, мг/г	Соотношение пигментов
Хл. а	хлb	каратиноиды	Хл. а	хлb	каратиноиды	хлa/хлb	Σ(хла+хлb)/ каратиноиды

Проанализировать результаты и сделать выводы о соотношении пигментов в изучаемых объектах. Сравнить полученные результаты в различных вариантах опыта, обсудить содержание и соотношение пигментов в листьях разных растений. Рассчитать процентное соотношение пигментов.

Работа 6. Образование крахмала в зеленых листьях на свету

Цель: оценить влияние различных факторов на способность растений образовывать первичный крахмал.

 

Объекты, реактивы, оборудование: проростки фасоли, комнатные растения ^__ пеларгония, проростки фасоли, колеус, примула; этиловый спирт, раствор иода в иодистом калии, лампа мощностью 200 Вт, ножницы, пинцет, лезвие бритвы, штатив с пробирками, водяная баня, электроплитка, держатели пробирок, чашки Петри, препаровальные иглы, сверла.

Краткие сведения

Наиболее простой метод обнаружения фотосинтеза ^__ крахмальная проба. Она состоит в том, что лист, выдержанный на свету, обесцвечивают спиртом, а затем обрабатывают раствором иода, окрашивающего образовавшийся в хлоропластах крахмал в темно-синий цвет. Опыт рекомендуется проводить со срезанными и поставленными в воду листьями, у которых крахмал накапливается быстрее, так как отток отсутствует.

Для наблюдения за процессом образования первичного крахмала необходимо, чтобы в начале опыта листья не содержали этого вещества. Обескрахмаливание листьев можно достичь, выдерживая их в течение нескольких дней и в темноте; за это время весь имевшийся в листьях крахмал превратится в сахара, которые будут частично отведены в стебель, а частично израсходованы на дыхание клеток листа

Ход работы

Для того, чтобы определить наличие крахмала в листьях, делают сверлом высечку между жилками листа, помещают ее в пробирку с водой, кипятят 2-3 мин, чтобы убить клетки. Воду сливают, приливают спирт и вновь кипятят на водяной бане, до полного извлечения пигментов. Нагревать следует осторожно, т.к. при бурном кипении может произойти выплескивание спирта из пробирки. Сливают спирт, размягчают ткань листа, наливая на него небольшое количество воды, т.к. после действия спирта она становится хрупкой. Помещают высечку в чашку Петри и добавляют раствор иода в иодистом калии. Через 3-5 мин раствор сливают и определяют содержание крахмала в листе по четырехбалльной шкале: иссиня-черный цвет ^__ 4 балла, темно-синий ^__ 3 балла, светло-синий ^__ 2, голубой ^__ 1, желтый (цвет раствора), отсутствие окраски ^__ 0.

Задача. Изучить влияние различных факторов на процесс образования крахмала:

1) у растений пеларгонии, колеуса, фасоли, помещенных в темноту на 48 ч;

2) у растений пеларгонии, колеуса, фасоли, предварительно обескрахмаленных, находившихся около лампы мощностью 200 Вт 40 мин,

3) у листьев пеларгонии, колеуса, фасоли, отделенных от растений (растения предварительно обескрахмалены в течение 48 ч), помещенных в стакан с водой около лампы 200 Вт на 40 мин;

Полученные результаты вносят в таб. 1.

Таблица 1

Объект	Вариант	Содержание крахмала, балл
лист	растение

 

Объяснить причины обескрахмаливания листа в темноте, отметить степень накопления крахмала при разной экспозиции на свету, различной интенсивности освещения в целом растении и срезанных листьях. Обсудить оптимальный вариант (условия, объект исследования) для демонстрации процесса образования крахмала в зеленых листьях на свету.

 

Работа 7. Образование сахара в зеленых листьях на свету.

Цель: оценить способность различных растений накапливать сахар в листьях

 

Объекты, реактивы оборудование: листья лука, чеснока, свеклы столовой; этиловый спирт, раствор иода в иодистом калии, реактив Фелинга, вода, водяная баня, электроплитка, штатив с пробирками, держатели пробирок, пинцет, препаровальные иглы, чашки Петри, сверла, воронки, бумажные фильтры.

 

Ход работы

В листьях исследуемых растений делают крахмальную пробу и приступают к определению редуцирующих сахаров. Нарезают на мелкие кусочки листья, заполняют ими на ¼ пробирку, заливают небольшим количеством воды и нагревают в кипящей водяной бане не менее 5 мин. Фильтруют полученную вытяжку, приливают к фильтрату реактив Фелинга, кипятят. При наличии моносахаров в пробирке выпадает оранжевый осадок оксида меди, количество которого оценивают по 4-балльной системе.

Задача. Выявить сахаробразующие растения, изучив содержание крахмала и моносахаров:

1) в листьях лука, чеснока, свеклы, выдержанных в течение 72 ч около лампы 100 Вт. Полученные данные занести в табл.1.

Таблица 1

Объект исследования	Повторность	Содержание сахаров, балл	Содержание крахмала, балл

 

Объяснить механизм образования органических веществ в зеленых листьях на свету. Обсудить возможность использования результатов данной работы для постановки школьного эксперимента.

Работа 8. Значение хлорофилла для образования в листьях крахмала

Цель: выяснить необходимость хлорофилла для образования крахмала

Объекты, реактивы оборудование: листья пестролистных растений: колеуса Блюмея, хлорофитума, пеларгонии, традесканции; реактивы и оборудование см. в работе «Образование крахмала в зеленых листьях на свету».

Краткие сведения

 

Результаты опыта, доказывающего значение хлорофилла для образования крахмала в листьях, зависят от правильного выбора объекта. Это должно быть, прежде всего, крахмалообразующее растение.

 

Ход работы

В листьях, предварительно выдержанных на свету растений, определяют содержание крахмала. В синий цвет окрашиваются только высечки с хлорофиллом, но это наблюдается у крахмалообразующих растений. Поэтому, если крахмальная проба не удается, проверяют наличие моносахаров.

Задача: определить значение хлорофилла для образования крахмала в листьях для пестролистных растений, указанных выше, сделав крахмальную пробу и реакцию на моносахара.

Результаты заносят в табл. 3.

 

Таблица 1

Объект исследования	Содержание крахмала по зонам, балл
Без хлорофилла	С хлорофиллом

 

Объяснить роль хлорофилла в процессе образования крахмала в листьях на свету. Анализируют полученные в работе данные, возможность использования изученных объектов для соответствующего демонстрационного опыта в школе.

 

ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ ПО ТЕМЕ «ФОТОСИНТЕЗ»

 

1. У каких листьев, световых или теневых, толщина мезофилла и содержание хлорофилла выше и почему?
2. Какую роль играют фикоэритрин красных и фикоцианин сине-зеленых водорослей? Участвуют ли они в процессе фотосинтеза?
3. Один лист выдержан на синем, другой, такой же, на красном свету равной интенсивности. В каких лучах будет более активное поглощение СО₂?
4. С помощью каких приемов можно отделить ксантофиллы, каротины от других пигментов?
5. При помощи какой реакции можно доказать, что атом металла придает хлорофиллу зеленый цвет и что хлорофилл — сложный эфир?
6. Спиртовая вытяжка хлорофилла несколько дней стояла на хорошо освещенном окне. Что произошло с пигментами?
7. На каком свету, только на красном или на красном и синем, фотосинтез будет протекать более активно?
8. Как объяснить кажущееся «избыточное» содержание хлорофилла в листьях растений?
9. После омыления хлорофилла к вытяжке листа добавили равное количество бензина, встряхнули и дали отстояться. Какова будет окраска спиртового и бензинового слоя, почему?
10. После повторных заморозков осенью трава приобретает буровато-оливковую окраску. Как объяснить изменение окраски? Жизнеспособны ли такие растения?
11. Почему при хроматографии на бумаге в бензине каротин движется с фронтом растворителя, а ксантофиллы расположены ниже?
12. Почему при хроматографии на бумаге в бензине хлорофилл а находится выше хлорофилла b?
13. При хроматографии пигментов на бумаге в. бензине на старте остается иногда некоторое количество зеленого пигмента. Что это за пигмент? Почему в отличие от других он не двигается?
14. При хроматографии смеси пигментов на бумаге в бензине оказалось, что полосы ксантофиллов, хлорофилла а и b плохо отделены одна от другой. Какой растворитель следует добавить к бензину, чтобы добиться разделения полос, почему?
15. Назвать желтые пигменты листа, каковы особенности их окраски? Каково отличие окраски хлорофилла а и b?
16. Как доказать необходимость света, углекислого газа для
    процесса фотосинтеза?
17. Каково положение главного максимума поглощения хлорофилла b растворе, в живом листе, почему?
18. Два одинаковых листа выдержаны в полной темноте для обескрахмаливания. Затем один был освещен монохроматическим светом с длиной волны 680 им, другой — в широкой области красной части спектра. Интенсивность световых потоков была одинакова. В каком листе окажется более высокое содержание крахмала?
19. Одна веточка элодеи освещена синим, другая — красным, третья — зеленым светом одинаковой интенсивности. В каких случаях будут быстрее выделяться пузырьки кислорода, почему?
20. Почему у многих растений в жаркие полуденные часы наблюдается не поглощение, а выделение СО₂?
21. Почему в опытах по обнаружению фотосинтеза методом крахмалыюй пробы срез черешка обескрахмаленного в темноте листа следует обновлять под водой?
22. При освещении, составляющем около 1% от полного солнечного, листья клена поглощают СО₂, листья дуба выделяют его, у листьев ивы не наблюдается ни выделения, ни поглощения его. Объяснить причину наблюдаемого явления.
23. Компенсационная точка для липы равна 50 лк, для дуба 200 лк. Какова причина этого различия?
24. Сколько органического вещества выработает растение за 15 мин, если известно, что интенсивность фотосинтеза составляет 20 мг/дм²-ч, а поверхность листьев равна 2,5 м²?
25. За 20 мин побег, листовая поверхность которого равна 240 см², поглотил 16 мг СО₂. Определить интенсивность фотосинтеза.
26. Почему при варке листья щавеля, петрушки приобретают буровато-коричневую окраску?
27. Почему у сосны в сомкнутом насаждении нижние побеги отмирают и опадают, а у ели нет?
28. В отличие от большинства растений у суккулентов устьица обычно закрыты в течение жаркого летнего дня и открываются только ночью. Как у них протекает фотосинтез, почему?
29. Почему такие растения, как сорго, кукуруза, сахарный тростник, могут успешно фотосинтезировать при закрытых в дневное время устьицах?
30. На свету у зеленого листа, который находился в атмосфере, лишенной СО₂, отмечается флюоресценция, тогда как в присутствии СО₂ флюоресценция прекращается. Как можно объяснить это явление?
31. За 30 минут растение, листовая поверхность которого составляет 250 см² поглотило 20 мг СО₂. Рассчитайте интенсивность фотосинтеза.
32. За 40 минут побег с листовой поверхностью 300 см² выделяет 10 мг О₂. Определите интенсивность фотосинтеза.
33. Чему равна интенсивность фотосинтеза, если побег с листовой поверхностью 3 дм² за 45 минут накопил 15 мг сухого вещества.
34. Сколько органического вещества вырабатывает растение за 15 минут, если известно, что интенсивность фотосинтеза составляет 20 мг СО₂/дм² ч, а поверхность листьев составляет 2,5 м²?
35. Какое биологическое значение имеет красная окраска глубоководных морских водорослей?
36. При каких условиях РБФК может действовать как оксигеназа? Каков вероятный результат этой реакции?
37. Рассчитайте листовую продуктивность фотосинтеза, если начальная биомасса растений с 1 м² составляет 42,5 г, а конечная — 412,3 г, время роста растений 10 дней. Площадь листьев растений в начале и в конце исследований равна 1,3 и 8,4 м² соответственно.
38. Определите величину ассимиляционного числа листа, который содержит 4,2 мг хлорофилла и поглощает 120 мг СО₂ за 3 часа.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Батурицкая Н.В., Фенчук, Т. Д. Удивительные опыты с растениями: кн. Для учащихся. – Мн.: Нар. асвета, - 1990.- 206 с.
2. Васильева З.В., Кириллова Г.А., Строчкова А.В. Учебно-методическое пособие по физиологии растений.— Москва «Просвещение», 1977.— 94 с.
3. Викторов Д.П. Практикум по физиологии растений.-2-е изд.- Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991.- 160 с.
4. Гавриленко, В.Ф. Большой практикум по физиологии растений: учебно-метод. пособие/ В.Ф. Гавриленко, М.Е. Ладыгина, Л.М. Хандобина.- М.: Высш. шк.- 1975.- 322 с.
5. Еремин В.М., Бойко В.И., Рой Ю.Ф., Зеркаль С.В. Малый практикум по физиологии растений. - Брест; Изд-во Брестского ун-та, 2000.— 88 с.
6. Малый практикум по физиологии растений: Учеб. пособие.— 9-е изд., перераб. и доп./ Под ред. А.Т. Мокроносова. — М.: Изд-во МГУ, 1994. — 183 с.
7. Медведев С.С. Физиология растений: Учебник.- СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004.- 336 с.
8. Пилильщикова И.В. Физиология растений с основами микробиологии- М.: Мир, 2004.- 182 с.
9. Полевой В.В. Физиология растений. –М., 1989.- 464 с.
10. Практикум по физиологии растений /Н.Н. Третьяков, Л.А. Паничкин, М.Н. Кондратьев и др.- М.: КолосС.- 2003.- 288 с.
11. Практикум по физиологии растений: Учеб. пособие для студ. высш. пед. учебн. заведен. / В.Б. Иванов, И.В. Плотникова, Е.А. Живухина и др./ Под ред. В.Б. Иванова – М.: Изд. центр «Академия», 2004.— 144 с.
12. Тарасенко С.А., Дорошкевич Е.И. Физиология и биохимия растений. Практикум: учебное пособие.— УО Гродненский го. аграр. университет, — Гродно.— 2004. — 210 с.
13. Туманов В.Н. Малый практикум по ФЗР/ В.Н. Туманов, С.Л. Чирук.- Гродно: ГрГУ, 2008. - 139 с.
14. Шабельская Э.Ф. Лабораторные занятия по физиологии растений. – учебн. пособие. — Мн.: «Вышэйшая школа», 1981, - 143 с.
15. Школьный физиологический эксперимент в курсе физиологии растений –метод. руководство/ Сост. Утыро Л.Б. – Мн.: МГПИ им. А.М. Горького, — 46 с.

Учебное издание

 

Мазец Жанна Эмануиловна

Судейная Светлана Васильевна

 

 

ПРАКТИКУМ ПО

ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

Часть I

 

 

Издается в авторской редакции

 

 

Ответственный за выпуск Л.М. Кореневская

Компьютерная верстка Ж.Э. Мазец

 

Подписано в печать. Формат 60х84¹/₁₆ Бумага офсетная. Гарнитура Arial. Печать Riso.

Усл.печ.л..Уч.-изд.л..Тираж 100 экз. Заказ.

 

Издатель и полиграфическое исполнение:

Учреждение образования «Белорусский государственный педагогический университет

имени Максима Танка»

ЛИ № 02330/0133496 от 01.04.04

ЛП № 02330/0131508 от 30.04.04

220050, Минск, Советская, 18.

 

 

Отпечатано с оригинал-макета заказчика в Учебно-издательском центре БГПУ.

220007, Минск, Могилевская, 37.

E-mail: [e-mail].