Схема микробиологической диагностики анаэробной раневой инфекции

МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной, раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, некротизированная ткань, перевязочный и шовный материал, содержимое матки, кровь из вены

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: ЭКСПРЕСС-МЕТОД, БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ, БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (ОСНОВНОЙ), БИОЛОГИЧЕСКИЙ, СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ, МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ

Экспресс-метод	Бактериологический метод	Биологический
1. РИФ (РНИФ) 2. Световая микроскопия 3. Посев в среду с лакмусовымвое с ев наматки кровь из вены. молоком по Минкевичу (Cl. perfringens створаживает молоко с образованием оранжево-красного губкообразного сгустка+газ = «штормовая реакция» в теч 1-3ч)	I ЭТАП:1. Посев на ППС: кровяной 2. Посев в среду Кита-Тароцци агар Цейсслера, железо-сульфитный (для уничтожения посторонней агар (среда Вильсона - Блера), вегетативной микрофлоры желточно-молочно-лактозный агар посевы в жидких средах (среда Виллиса-Хоббса) прогревают при 80^0С в течение 15-20 мин). Инкубация при 37^0С 2-8 суток в анаэростате Инкубация при 37^0С 15 суток, просматривая ежедневно Кровь на гемокультуру высевают в количестве 10% к объему ЖПС, инкубация 3 сут.   II ЭТАП:1. Изучение характера роста 1. Изучение характера роста в среде на ППС (R,S.M формы колоний) Китта-Тароцци с посевами первич- (на кровяном агаре – гемолиз, ного материала (помутнение среды на среде Вильсона-Блера – с газообразованием). колонии черного цвета). 2. Мазок из осадочного материала, 2. Отбор подозрительных колоний. окраска по Граму, микроскопия. 3. Мазок из подозрительных колоний,окраска 3. Посев на ППС для получения по Граму, микроскопия. изолированных колоний и 4. Посев в среду Китта-Тароцци или в высокий дальнейшего выделения чистой столбик агара для выделения чистой культуры. культуры III ЭТАП: 1. Контроль чистоты культуры (визуально и микроскопически) 2. Идентификация выделенной культуры: а) посев в «пестрый» ряд, образование индола, разжижение желатина и свернутой сыворотки или яичного белка (см. приложение); б) определение лецитиназной и липазной активности клостридий на среде Виллиса-Хоббса. в) определение видовой принадлежности с помощью РБН в организме животных со специфическими противогангренозными сыворотками. IV ЭТАП:Учет полученных результатов. Окончательный ответ.	I ЭТАП:(пробы на 5 группах животных): 1 группе животных (морские свинки или белые мыши) – вводят фильтрат исследуемого материала. 2 группе животных – вводят смесь фильтрата исследуемого материала с антитоксической противогангренозной поливалентной сывороткой, выдержанную при 20^0С в течение 40 мин. 3, 4, 5 группам животных – вводят смесь фильтрата исследуемого материала с каждой видоспецифической антитоксической противогангренозной сывороткой. Наблюдение в течение 3 суток. II ЭТАП:Учет результатов (при положительной реакции не гибнут животные 2-й и одной из 3, 4, 5 групп в зависимости от соответствия исследуемого токсина противогангренозной антитоксической сыворотке).
Бактериоскопический метод
1. Фиксированный препарат, окраска по методу Грама, микроскопия. 2. Фиксированный препарат, окраска метиленовым синим, микроскопия. 3. Фиксированный препарат, окраска по методу Ожешко, микроскопия. 4. Фиксрованный препарат, окраска по Бури-Гинсу, микроскопия. 5. Микроскопия методом «висячая капля»

 

 

Серологический метод	Молекулярно - биологические методы
РНГА, ИФА (для выявления антигенной специфичности токсинов). При наличии высокоспецифичных иммуноглобулиновых тест-систем возможна идентификация вида микроорганизмов.	1. ПЦР в режиме реального времени и RAPD-ПЦР. 2. Риботипирование и рестрикционный анализ гидролизатов ДНК. 3. ГЖХ (выявления летучих, нелетучих жирных кислот и основных аминов в среде после культивирования анаэробов).

 

 

ПРИЛОЖЕНИЕ I. ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННЫХ АНАЭРОБОВ

 

Признаки	Cl. perfringens	Cl. novyi	Cl. septicum	Cl. histolyticum	Cl.tetani	Cl. botulinum
Подвижность	-	+	+	+	+	+
Образование капсулы	+	-	-	-	-	-
Форма колоний на кровяном агаре	Круглые гладкие с зеленоватой зоной гемолиза	Шероховатые с зоной гемолиза	Нежный кружевной рост с зоной гемолиза	Мелкие, гладкие с зоной гемолиза	1.мелкие кружевные; 2.мелкие с зоной гемолиза	Мелкие с ровными или изрезанными краями с зоной гемолиза
Рост в столбике сахарного агара	S-в виде комков ваты R-чечевицеобразные	S	S,R	Мелкие, плотные неправильной формы	S, R	R
Ферментация углеводов	Глюкоза Лактоза Сахароза	+ К, Г + К, Г + К, Г	+ К, Г - -	+ К, Г + К, Г -	- - -	+ /- К, Г - --	+ К, Г - -
Протеолитическая активность	Желатин     Лакмусовое молоко	ГД (гидролиз)     СГ	ГД     СГ	ГД     СГ	ГД     СП (свертывание, пептонизация)	ГД (рост в столбике в виде елочки)   -	ГД   -
Рост на среде Виллиса-Хоббса	Липазная активность (белая опалесценция) Лецитиназная (жемчужная опалесценция)	+   -	-   +	-   -	-   -	-   -	-   -
Образование индола и H2S	+	+	+	+	+	+
Токсины, обладающие свойствами ферментов	α β γ δ ε ζ η θ ι κ λ μ ν, энтеротоксин у серотипов А и С	α β γ δ ε ζ η θ	α β γ δ	α β γ δ ε	Тетаноспазмин, тетанолизин	экзотоксин 7 типов (наиболее распространены А, B, E)

 

ПРИЛОЖЕНИЕ II. ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИНОВ ПАТОГЕННЫХ АНАЭРОБОВ.

 

α (альфа), β (бета), γ (гамма) - лецитиназа С

δ (дельта) - гемолизин

ε (эпсилон) - липаза

ζ (зета) - желатиназа

η (эта) - тропомиозиназа

θ (тета) - эластаза Дерматонекротическое, гемолитическое, летальное действие

ι (йота) - фибринолизин

κ (каппа) - коллагеназа

λ (лямбда) - протеиназа

μ (мю) - гиалуронидаза

ν (ню) - ДНК-аза