Схема микробиологической диагностики холеры

МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: рвотные массы, испражнения, желчь, трупный материал (проба из стенки тонкого кишечника, содержимое желчного пузыря), вода, пищевые продукты, гидробионты, мухи, сточные воды

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ, БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (ОСНОВНОЙ), СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ

Экспресс-методы	Бактериологический метод
1. РИФ с использованием флюоресцирующих холерных сывороток (О1 и О139). 2. РИВ (иммобилизация вибрионов холерными сыворотками О1, О139 и типовыми холерными фагами). 3. РНГА и РТНГА. 4. ИФА. 5. ПЦР.	I ЭТАП:Посев в щелочную 1% пептонную воду (среда обогащения). Инкубация при 37^0С в течение 5-6 часов. II ЭТАП (через 6-8 часов от начала исследования): 1. Изучение характера роста (наличие нежной пленки). 2. Мазок, окраска по Граму, микроскопия. 3. Приготовление препарата «висячая» или «раздавленная» капля. 4. РА на стекле с холерными сыворотками О1 и О139. 5. При отрицательных результатах исследования нативного материала осуществляется постановка реакций: РИФ, РИВ, РНГА, ПЦР с использованием пептонной воды. 6. Постановка нитрозоиндоловой пробы (предварительный положительный ответ). 7. Посев на 2-ю пептонную воду. Инкубация при 37^0С 6-7 часов. 8. Посев на щелочной питательный агар. Инкубация при 37^0С 12 часов. III ЭТАП(через 12-14 часов от начала исследования): 1. Изучение характера роста на 2-й пептонной воде. 2. Посев из 2-й пептонной воды на щелочной агар. Инкубация при 37^0С 12 часов. 3. Изучение характера роста на щелочном питательном агаре. 4. Отбор подозрительных колоний. 5. Мазок из подозрительных колоний, окраска по Граму, микроскопия. 6. Приготовление препарата «висячая» капля. 7. Развернутая РА с сыворотками типа Огава и Инаба. 8. Посев на среды Олькеницкого и Ресселя. Инкубация при 37^0С 12 часов.	Посев на щелочной питательный агар. Инкубация при 37^0С 10-12 часов.   1. Изучение характера роста. 2. Отбор подозрительных колоний. 3. Мазок из подозрительных колоний, окраска по Граму, микроскопия. 4. РА на стекле с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, О139. 5. Пересев на среды Олькеницкого и Ресселя. Инкубация при 37^0С 12 часов (через 12-14 часов от начала исследования): 1. Изучение характера роста. 2. Контроль частоты культуры (визуально и микроскопически) 3. Идентификация выделенной культуры: - РА на стекле с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, О139 (при отрицательных результатах проводят слайд – агглютинацию с холерной сывороткой РО (RO); - посев в «пестрый» ряд для определения группы Хейберга; - постановка оксидазного теста; - проведение гексаминовой пробы; - проведение реакции Фогеса-Проскауэра; - посев на кровяной агар; - РА куриных эритроцитов; - развернутая РА с О-сывороткой и с типовыми агглютинирующими сыворотками. - фаготипирование. - посев на среду с полимиксином. - ПЦР с целью выявления гена, кодирующего выработку холерного энтеротоксина. - определение типа расщепления глюкозы на среде Хью-Лейфсона (OF – тест; О – окисление, F - ферментация в аэробных и анаэробных условиях); - определение отношения к аминокислотам (лизин, орнитин, аргинин).   4. Определение чувствительности к антибиотикам.
IV ЭТАП(через 18-24 часов):См. III этап посевов на щелочной питательный агар.
V ЭТАП:через 36-48 часов от начала исследования Учет полученных результатов. Предварительный положительный ответ может быть выдан через 5-6 часов. Окончательный ответ через 18-48 часов.
Серодиагностика
1. РА с парными сыворотками. 2. РВА (реакция определения вибриоцидных антител) 3. РНГА с эритроцитарным холерным диагностикумом. 4. РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД). 5. Определение токсин-нейтрализующих антител при помощи липосомального эритроцитарного диагностикума (ЛХЭД). 6. Для ретроспективной диагностики: РНГА, РТНГА, реакция лизиса, ИФА