Правила техники безопасности в учебном процессе

Занятие №1

Тема: «Техника микроскопии и приготовления гистопрепаратов»

Цели занятия:

1. Ознакомиться с правилами техники безопасности в учебном процессе и организацией рабочего места студента-гистолога.

2. Ознакомиться с содержанием основных этапов изготовления фиксированного и окрашенного гистологического препарата

3. Получить представление о тинкториальных свойствах структур в гистологическом препарате.

4. Ознакомиться с использованием общих или специальных методов выявления изучаемых структур.

5. Ознакомиться с правилами оформления лабораторной работы.

Приготовление тотальных препаратов

В некоторых случаях объект исследуют целиком без приготовле­ния срезов и, следовательно, без предварительного уплотнения. Обычно такими объектами являются тонкие структуры – сероз­ные, мозговые, зародышевые оболочки, тонкостенные сосуды и т. д. Препараты объектов, исследуемых целиком, называются тоталь­ными. При изготовлении тотальных препаратов сальника, брыжей­ки, мозговых оболочек из них вырезают кусочки и опускают в фик­сатор. При изучении зародышевых оболочек можно ввести фикса­тор шприцем в амнион. Если орган может при фиксации изменить свою форму и деформировать покрывающую его оболочку (напри­мер, серозную оболочку передней брюшной стенки), его прикалы­вают стеклянными иглами оболочкой вверх к пластинке пробки и опускают в фиксатор объектом вниз. При исследовании сосуда фик сирующего жидкость вводят на некоторое время в его просвет, затем сосуд разрезают вдоль, материал накалывают на пробку эндо­телием вверх и фиксируют описанным выше способом.

Окрашивание и заключение тотальных препаратов производятся так же, как ненаклеенных целлоидиновых и замороженных срезов.

Методы исследования

Современная гистология располагает большим арсеналом средств для изучения биологических структур на всех уровнях их организации – клеточном, тканевом, органном. Основными объектами исследования являются гистологические препараты или их фотографии, классическим методом – микроскопирование.

Световая микроскопия наиболее распространенный способ изучения гистологических структур. Современные биологиче­ские микроскопы дают максимальное (до 2500 раз) увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра).

Люминесцентная микроскопия позволяет наблюдать флуорес­ценцию (свечение) ряда веществ и структур, возбуждаемую ульт­рафиолетовыми и сине-фиолетовыми лучами спектра. Флуорес­центная микроскопия является методом прижизненного наблюде­ния клеток. Она позволяет не только рассмотреть ряд структур в них, но и определить их химический состав.

Электронная микроскопия – это метод изучения субмикро­скопических структур клетки. В электронном микроскопе роль линз выполняют электромагниты, фокусирующие пучок электро­нов на препарат. Объект рассматривают на светящемся экране или фотографируют. Разрешающая способность электронного микроскопа примерно в 100 раз больше, чем светового, что дает возможность исследовать клеточные структуры на молекулярном уровне.

Цитохимические методы позволяют выяснить химическую природу клеточных структур и характер распределения тех пли иных веществ в клетке. Разработаны методы цитохимическо­го анализа основных соединений, входящих в состав структур клетки (белков, нуклеиновых кислот, углеводов, ферментов).

Задание 1. Изучить устройство светового микроскопа, являющегося постоянным рабочим инструментом при изучении курса гистологии и записать в тетрадь основные его части. Научиться пользоваться микроскопом.

Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для изуче­ния прозрачных объектов, невидимых простым глазом. В световых биологических микро­скопах различают две основные части: механическую и оптическую (рис. 5А).

Рис.5. Микроскоп для биологических исследований.

Механическая часть:

1 – основание;

2 – тубусодержатель

3 – тубус;

4 – коробка механизма микроподачи;

5 – револьверное устройство;

6 – предметный столик с зажимами-клеммами;

7 – макрометрический винт (кремальера);

8 – микрометрический винт;

9 – винт конденсора.

Оптическая часть:

10 – окуляр (с различной степенью увеличения ×5, ×7, ×10, ×15);

11 – объективы (рис. 5.Б):

а) малого увеличения (×8)

б) большого увеличения (×40)

в) иммерсионного увеличения (×90)

«Сухие» объективы работают в обычных условиях – без дополнительных маркировок; иммерсионные объективы работают при наличии иммерсии – с дополнительными маркировками в виде полос. Цвет полосы показывает природу иммерсии: чёрная полоса – иммерсия масленая, белая полоса – иммерсия водная.

С оптической частью связано осветительное устройство, кото­рое включает в себя: 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало с двумя поверхностями – вогнутой и плоской.

Правила пользования микроскопом:

1. Удобно поставить микроскоп на столе.

2. Револьвер замкнуть на засечку, поставив при этом объектив малого увеличения – 8. Фокусное расстояние должно быть при этом около 1 см от объектива.

3. Установить освещение при малом объективе, повернув вогну­тое зеркало к источнику света так, чтобы поле зрения было освещено равномерно и достаточно хорошо.

4. Положить препарат на предметный столик, чтобы покровное стекло гистологического препарата было сверху.

5. Рассмотреть препарат при слабом увеличении. Найти нужный участок для последующего детального изучения и поставить его в центр поля зрения микроскопа. Препарат закрепить зажимами и по­вернуть револьверное устройство на сильный объектив до щелчка.

6. Очень осторожным движением винта кремальеры «на себя» установить фокус сильного увеличения и микровинтом отфокусировать объект (фокусное расстояние около 1-2 мм).

7. Рассмотреть препарат при сильном увеличении, периодиче­ски вращая микрометрический винт в обе стороны на четверть обо­рота для того, чтобы лучше просмотреть глубокие слои изучаемого препарата.

8. Изучить препарат, зарисовать и обозначить.

По окончании изучения и зарисовки препарата следует поднять тубус, перевести револьвер на слабое увеличение и только тогда ос­вободить зажимы и снять препарат со столика микроскопа. При ма­лом увеличении конденсор должен быть опущен, а при большом – поднят.

Приготовить окулярную указку для микроскопа. Вынуть окуляр и снять его наружные размеры, т. е. изобразить на плотной бумаге (альбомный лист) в виде круга. Внутренние размеры определить по световой линзе. Затем вырезать кольцо. К его поверхности приклеить волос по радиусу центрального поля. По­сле проверки преподавателем правильности изготовления указки поместить ее между линзами окуляра. Для этого отвернуть (против часовой стрелки.) глаз­ную линзу, вставить указку и завернуть линзу обратно.

Типы микроскопов

Биомед · ЛОМО · Olympus · Nikon

Учебные · Лабораторные · Исследовательские

 

Таблица 1. Прямые микроскопы

Модель	Тип	Объективы	Окуляры
Биомед:
Биомед С1и	монокуляр	10×/40×/100×МИ	5×/10×/16×
БиомедС2 вар.4	монокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	WF10×
Биомед - 1	би-/тринокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	WF10× /WF16×
Биомед - 2	тринокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	WF10× /WF16×
ЛОМО:
Микмед-1 вар.1.20	монокуляр	10×/40×/100×МИ	10×
Микмед-1 вар.2.20	бинокуляр	10×/40×/100×МИ	10×
Микмед-1 вар.6	бинокуляр	10×/20×/60×/90×МИ	5×/7×
Микмед-1 вар.2	бинокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×/15×
Olympus:
СХ 21	бинокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×
СХ 31	бинокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×
СХ 41	би-/тринокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×
Nikon:
YS 100	бинокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×
E 200 F	би-/тринокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×

 

 

Рис.6. Микроскоп Биомед – 2

Рис.7. Микроскоп Микмед-1 вар. 2.20 (ЛОМО)

 

Простые лабораторные бинокулярные микроскопы предназначены для биологических, биохимических, патологоанатомических, цитологических, гематологических, урологических, дерматологических и общеклинических исследований.

 

Рис.8. Микроскоп СХ 21 (Olympus) – компактный микроскоп с высоким качеством оптики, предназначен для лабораторий общеклинических исследований, идеален для лабораторий с ограниченным рабочим местом, бинокуляр, скорректированная на бесконечность оптика.

 

 

Таблица 2. Люминесцентные микроскопы

Модель	Тип	Объективы	Окуляры
Биомед:
Биомед 2Л	тринокуляр	10×/20×/40×/100×МИ	10×/16×
ЛОМО:
Микмед-2 вар.11	бинокуляр	10×/20×/40×БПС/100×МИ	6,3×/10×/15×/ 15× со шкалой
Микмед-2 вар.12	бинокуляр	10×/20×/40×БПС/100×МИ	6,3×/10×/15×/ 15× со шкалой
Olympus:
СХ 31	бинокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×
СХ 41	би/тринокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×
Nikon:
200 F	би/тринокуляр	4×/10×/40×/100×МИ	10×

 

 

 

Рис.9. Микроскоп Биомед 2Л

 

Люминесцентные микроскопы предназначены для иммунологических исследований с применением флюоресцирующих и ферментных меток, а также гистологических и цитологических исследований в клинической лабораторной диагностике.

 

Таблица 3. Поляризационные микроскопы

Модель	Тип	Объективы	Окуляры
ЛОМО:
Полам P-211М	бинокуляр	2,5×/10×/60×/60×	10×
Полам P-213М	тринокуляр	2,5×/10×/60×/60×	10×
Полам P-312	тринокуляр	4,7×/9×/21×/40×/95×	6,3×/10×

 

Поляризационные микроскопы предназначены для исследований непрозрачных объектов в отраженном свете, обыкновенном и поляризованном, а также прозрачных объектов в проходящем свете. Области применения: петрография, минералогия, кристаллография, углепетрография, биология, медицина, химия, криминалистика.

Рис.10. Микроскоп Полам Р – 312 (ЛОМО)

Таблица 4. Инвертированные микроскопы

Модель	Тип	Объективы	Окуляры
ЛОМО:
Биолам П2-1	бинокуляр	2,5×/6,3×/10×/20×	10×,15×
Olympus:
СКХ 31	бинокуляр	4×/10×/20×/40×	5×,10×,12.5×,15×
СКХ 41	бинокуляр	4×/10×/20×/40×	5×,10×,12.5×,15×
Nikon:
TS 100	би/тринокуляр	4×/10×/20×/40×	5×,10×,12.5×,15×

 

Инвертированные микроскопы предназначены для исследования клеточных культур, находящихся в специальной лабораторной посуде. Области применения: иммунология, биотехнология, бактериология, фармакология, биология, сельское хозяйство, экология.

Рис.11. Биолам П2-1 (ЛОМО)

 

Таблица 5. Стереомикроскопы

Модель	Тип	Рабочее состояние	Увеличение
Биомед:
Биомед МС-1	бинокуляр	105 мм	до 80×
Лыткарина:
МБС - 10	бинокуляр	95 мм	до 100×
Olympus:
Серия SZ	би-/тринокуляр	до 110 мм	от 3,4 до 330×
Серия SZХ	би-/тринокуляр	до 198 мм	до 675×
Nikon:
SM-5	бинокуляр	110 мм	от 10× до 60×
SMZ-645/660	би-/тринокуляр	115 мм	от 4× до 300×

 

Стереомикроскопы предназначены для наблюдения прямого объемного изображения предметов в отраженном или проходящем свете при естественном или искусственном освещении. Микроскопы применяются в криминалистике, биологии, медицине, минералогии, археологии, машиностроении, приборостроении и других областях науки и техники. Микроскопы могут комплектоваться осветителями светлого поля, темного поля, косого света, отраженного света и люминесцентным осветителем.

Рис. 12. Микроскоп Биомед МС-1

Материалы

Таблица 6. Получение слабых спиртов

Для получения 100 мл	Нужно взять, мл
96% спирта	воды	90% спирта	воды	80% спирта	воды	70% спирта	воды
45%
50%
60%
70%							-	-
80%					-	-	-	-
90%			-	-	-	-	-	-

Приготовление эозина

Эозин – это кислый краситель, окрашивающий цитоплазму клетки.

0,1 грамм или 500 мг эозина смешиваем с 100 мл дистиллированной водой (спиртовой раствор 0,1 %).

Простые фиксаторы

Формалин (формол) является самым дешевым и распространенным фиксатором. В чистом виде представляет, светлую, сильно пахнущую жидкость, состоящую из 40% водного раствора формальдегида. Применяется преимущественно в виде 10-20% водного раствора, для чего 1 часть неразведенного формалина разводят 9 или 4 частями воды. Приготавливают раствор обязательно на водопроводной воде, так как дистиллированная вызывает набухание тканей. Широкое применение формалин получил благодаря ряду свойств:

а) высокой степени диффузии;

б) способности хорошо сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта;

в) оказывать длительное фиксирующее действие (до нескольких лет), существенно не ухудшая при этом качество материала;

г) хорошо сохранять жиры и липоиды.

Высокая диффузионная способность и незначительное осаждающее действие позволяют формалину довольно быстро и глубоко проникать в ткани, что позволяет фиксировать кусочки органа от 1 см и более, а при необходимости и довольно крупные органы целиком.

Срок фиксации тканей в формалине 24-48 часов. Обычный формалин, как правило, содержит примесь метилового спирта и муравьиной кислоты, количество которой увеличивается под влиянием света.

При охлаждении формалина в растворе появляется муть, оседающая в виде белого осадка (параформальдегид). Такой же осадок наблюдается на стенках сосуда и при испарении формалина. Поэтому формалин следует хранить в темной плотно закрывающейся стеклянной посу­де, при температуре не ниже 9°С.

Нейтрализация формалина.Примесь в формалине муравьиной кислоты придает раствору слабокислый характер, что нежелательно при применении ряда методов исследования (некоторые гистохимические реакции, сереб­рение раствором азотнокислого серебра). Способ нейтрали­зации формалина довольно прост: в сосуд засыпают угле­кислый кальций (или углекислую магнезию) в таком коли­честве, чтобы на дне образовался слой толщиной 1,5-2 см. Затем наливают формалин, несколько раз энергично встря­хивают и оставляют стоять 24-48 часов. В течение этого времени происходит нейтрализация раствора.

Побочные действия формалина. Длительное хранение препаратов в концентрированном растворе форма­лина придает тканям чрезмерную плотность, затрудняющую дальнейшую обработку и ухудшающую качество препарата. Устранение этого недостатка' возможно путем помещения материала на 2 недели в 1 % раствор азотнокислого серебра или 10% раствор лимонной кислоты. Длительное хранение в 10% растворе формалина приводит также к набуханию объекта, что необходимо помнить при его измерении после фиксации.

При фиксации формалином в препаратах нередко появ­ляется темно-коричневый кристаллический осадок – резуль­тат взаимодействия формалина с находящимся в тканях ге­моглобином. Его удаляют путем помещения неокрашенных срезов в 1-5% раствор нашатырного спирта или 70° этило­вый алкоголь на различные сроки (от 5 минут до 4 часов). Затем препарат тщательно промывают и ведут дальнейшую обработку.

Следует постоянно помнить, что длительное действие паров формалина сильно раздражает слизистые оболочки. Смачивание кожи формалином оказывает дубящий эффект, а при повторных частых кон­тактах вызывает сухую экзему. Поэтому перед препариро­ванием формалиновые препараты помещают в слабо ам­миачную воду (для устранения запаха) и работают в ре­зиновых перчатках.

Этиловый спирт. Фиксирующее действие осуществляет­ся за счет отнятия у тканей воды и коагуляции белков. Не­смотря на ряд отрицательных свойств спирта (сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворение и экстракция жиров и гемоглобина), он как фиксатор нахо­дит широкое применение в микроскопической технике. Это объясняется тем, что этиловый спирт осуществляет быструю фиксацию, не требующую после себя обезвоживания тканей перед заливкой в парафин и целлоидин. Будучи химически неактивным веществом, спирт особенно пригоден при гисто­химических исследованиях. В нем полностью сохраняются такие вещества, как муцины, гликоген, мочевая кислота, же­лезо, кальций, которые легко растворимы в других фикси­рующих жидкостях.

Этиловый спирт применяется чаще в виде 96° и абсолют­ного спирта. Некоторые авторы рекомендуют также кон­центрации 80 и 90°. Время фиксации зависит от материала: для тонких пленок 15-30 минут, для кусочков толщиной 3-4 мм -2-4 часа. В связи с тем что спирт легче воды, последняя, экстрагируясь из тканей, опускается на дно. Поэтому под кусочки исследуемого материала нужно обя­зательно подкладывать толстый слой ваты. Излишнее пре­бывание препарата в спирте вызывает чрезмерное уплотне­ние ткани, что плохо отражается на последующей ее обра­ботке.

Метиловый спирт (метанол). Бесцветная жидкость, в чи­стом виде напоминает по запаху этиловый спирт, техниче­ский же (неочищенный) метанол обладает неприятным за­пахом, обусловленным примесью других веществ. В микро­скопической технике применяется в виде абсолютного, лишенного примесей спирта, для фиксации мазков крови. Лучше всего пользоваться метанолом, предназначенным для анализа.

Следует помнить, что метанол является сильным ядом и требует соблюдения правил употребления и хране­ния, предусмотренных для ядовитых веществ группы А. Из других фиксирующих веществ следует упомянуть аце­тон, сулему, соли тяжелых металлов (ртуть, кобальт, пла­тина, уран и т. д.) и кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, осмиевая, хромовая и Др.). В чистом виде эти вещества применяются редко, но зато являются составной частью многих фиксирующих смесей.

Промывание

Эта процедура преследует цель освобождения исследуе­мого объекта от излишнего количества фиксатора. Способ промывки зависит от методики фиксации. Например, после фиксирующих смесей, содержащих пикриновую кислоту, сулему, трихлоруксусную кислоту, применяют этиловый спирт разной концентрации (см. предыдущий раздел). После фиксации в формалине, в жидкостях, содержащих хром, осмиевую кислоту, обычно употребляют воду. В подавляющем большинстве случаев промывку кусочков тканей производят в проточной водопроводной воде. Наиболее удобно это делать, помещая объект в стеклянные или фарфоровые сита (рис.15), которые закрывают пробкой и опускают в сосуд с проточной водой. Пробка обеспечивает плавучесть, а отверстие – постоянную циркуляцию воды. Если кусочек не прошит ниткой, то этикетку также помещают в сито.

 

 

Рис.15. Промывка материла после фиксации

 

При отсутствии сита кусочек заворачивают в марлю и подвешивают за нитку в сосуд, наполненный водой. Вверх сосуда закрывают марлей и проделывают в ней небольшое отверстие. На водопроводный кран натягивают резиновый шланг или привязывают шнур (полоску бинта), свободный конец которого пропускают через марлю в сосуд и пускают по нему несильную струю воду. Среднее время промывки 20-24 часа.

Обезвоживание

Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата, следует строго придерживаться правила постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани.

Несмотря на то, что большинство фиксаторов в процессе своего действия уплотняют материал, этого уплотнения недо­статочно для изготовления срезов. После промывки кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации.

Для проведения процедуры приготавливают необходи­мое количество бюксов или стаканчиков с притертыми крышками, этикетируют их и заливают спиртами: 50, 60, 70, 80 и 96° (два стаканчика), 100° (два стаканчика). Такой последовательный ряд сосудов получил название гистологической батареи.

Спирты нужной крепости приготавливают заранее по специальной таблице разведения (табл. 2) из 96° спирта (для того чтобы приготовить 100 мл спирта крепостью 60°, необходимо взять 63 мл 96° спирта и 37 мл дистиллированной воды и т.д.).

Способ приготовления абсолютного спирта. Обычный спирт-ректификат содержит 96% чистого спир­та и 4% воды. Для того чтобы получить абсолютный спирт; необходимо извлечь эту воду. Наиболее распространенным способом является обезвоживание при помощи прокаленного медного купороса (сернокислая медь).

В основе этого метода лежит свойство медного купоро­са отдавать и присоединять молекулы воды, меняя при этом, свой цвет (прокаленная сернокислая медь имеет вид серовато-белого порошка, который по мере присоединения воды приобретает синюю окраску).

Насыпав порошок прокаленного медного купороса (при­мерно 10 г на 100 мл спирта) в чистую стеклянную бутыл­ку с притертой пробкой, наливают туда же 96° спирт. Затем бутылку встряхивают до равномерного распределения по­рошка. Подобную процедуру повторяют на протяжении 1-2 дней. По мере поглощения воды порошок приобретает синюю окраску. Однократная обработка, как правило, не дает обезвоживания, поэтому спирт переливают в другой сосуд, содержащий свежую порцию сернокислой меди. По­добную процедуру повторяют до тех пор, пока осадок не перестанет приобретать голубой цвет. Обезвоженный спирт отфильтровывают в чистую посуду, которую плотно закры­вают. Желательно проверить рН абсолютного спирта, так как после обработки медным купоросом он может стать слегка подкисленным. Для нейтрализации достаточно прибавить небольшое количество карбоната кальция (СаСО₃).

Если в лаборатории нет фабричного порошка безводного медного купороса, то его можно приготовить самим, прока­лив кристаллическую соль над огнем в широкой фарфоро­вой чашке (до тех пор, пока из синих кристаллов не обра­зуется белый порошок). Для равномерного прокаливания необходимо перемешивать купорос стеклянной палочкой. Нельзя допускать почернения (особенно заметного по краям чашки), свидетельствующего о перекаливании. Таким же путем обрабатывают медный купорос, оставшийся после обезвоживания спирта.

Следует помнить, что порошок медного купороса сильно раздражает слизистые оболочки. Прокаливание нуж­но проводить в вытяжном шкафу или же защищать слизи­стые оболочки носа и рта обычной марлевой маской. Испытание абсолютного спирта на содержание воды про­изводят опусканием в него нескольких зерен карбида каль­ция. Появление характерного запаха ацетилена и помутне­ние свидетельствуют о наличии воды. Более грубый спо­соб – прибавление нескольких капель абсолютного спирта к 4-5 мл бензола или ксилола. Помутнение жидкости ука­зывает на то, что спирт содержит около 3% воды.

Если препарат промывали в воде, то обезвоживание на­чинают с 50° спирта, если же в спиртах (после жидкости Ценкера и др.), то объект помещают в спирт последующей крепости (из 70° в 80° и т. п.). При тонких цитологических исследованиях обезвоживание начинают с 10-20° спирта. Время пребывания кусочков в отдельных спиртах опреде­ляется их величиной и свойствами. Объекты средней вели­чины (толщиной 5 мм) достаточно держать в слабых спир­тах (до 60°) по 2-4 часа, а в более крепких от 12 до 24 ча­сов. Мелкие и более тонкие объекты можно проводить соответственно быстрее.

Для того чтобы спирт проникал в ткани равномерно со всех сторон, объект помещают на слой ваты (обычной или стеклянной) или подвешивают в стеклянном сите. При та­ком расположении кусочков спирт, отнимающий воду из тканей и стекающий ко дну, не мешает дальнейшему обез­воживанию.

Следует помнить, что длительное пребывание объекта в спиртах низкой концентрации приводит к ма­церации тканей, в то время как передержка в спиртах вы­сокой концентрации чрезмерно уплотняет их. Поэтому, если необходимо прервать процесс обезвоживания, то матери­ал можно оставить (на несколько дней) в «индифферент­ном» спирте, крепость которого составляет 70-80°.

Необходимо также учитывать, что спирты в процессе обезвоживания довольно быстро загрязняются экстрагируе­мыми из тканей веществами и особенно жирами. Не следует использовать длительное время одни и те же спирты. Не­обходимо своевременно их сменять.

В процессе обезвоживания могут быть ошибки: 1) пере­уплотнение при полном обезвоживании, 2) нормальное уп­лотнение при недостаточном обезвоживании. Оба эти недо­статка являются следствием несоблюдения оптимальных ус­ловий обезвоживания и отрицательно сказываются на дальнейшей обработке материала. Достижение хороших ре­зультатов дается только опытом, поэтому необходимо тща­тельно регистрировать все этапы и внимательно анализи­ровать результаты (особенно при освоении методов).

Перед тем как перенести объект в 96° или абсолютный спирт, следует придать кусочку окончательную форму и размеры (обрезать поврежденные или излишние участки). Для полного обезвоживания следует проводить материал последовательно через две порции абсолютного спирта (по 12-24 часа).

Пропитывание и заливка

Приготовление высококачественных гистологических пре­паратов требует наличия равномерно тонких срезов с ис­следуемого объекта. Для того чтобы их получить, кусочки тканей надо пропитать и залить такой средой, которая пре­вратила бы их в хорошо режущуюся массу.

Следует помнить, что процесс пропитывания и заливки исследуемого материала требует большой тщательности. Незнание основных принципов и несоблюдение необходи­мых условий может привести к тому, что объект окажется непригодным для резки или полученные срезы будут нека­чественными.

Наиболее употребительными для этих целей материала­ми являются парафин, целлоидин и желатин.

Заливка в парафин

Этот метод широко распространен в исследовательских гистологических лабораториях благодаря относительной быстроте заливки (в течение 1-2 дней после обезвожива­ния), возможности приготовления серийных срезов, а также тонких срезов для цитологических исследований (толщина 2-3 мкм), удобству хранения блоков и неокрашенных срезов (практически неограниченное время). К недостаткам мето­да следует отнести значительное сжатие исследуемого материала (до 20%), вызываемое воздействием высокой температуры в процессе пропитывания парафином. Богатые водой, рыхлые ткани мало пригодны к заливке в парафин. Известное неудобство представляет необходимость удале­ния парафина из срезов перед их окраской.

Парафин при комнатной температуре – твердое гомо­генное вещество. Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45-54°) и твердые (точка плав­ления 58-60°).

В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54-56°. Если резка предполагается при низкой температуре окружающей среды, то лучше приме­нять парафин с более низкой точкой плавления (48-50°). Нужная степень твердости парафина достигается смешива­нием в различных комбинациях мягких и твердых сортов.

Если неизвестна точка плавления парафина, ее можно определить самому. Для этого расплавленный парафин на­сасывают в тонкий стеклянный капилляр и дают ему за­стыть. Затем очищают капилляр снаружи от приставшего парафина и вместе с градусником опускают в химический стаканчик с водой, которую начинают постепенно нагревать, перемешивая стеклянной палочкой. Как только парафин в капилляре начнет расплавляться, отмечают температуру, которая и укажет точку его плавления.

Следует помнить, что обычный продажный пара­фин часто содержит газообразные примеси, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повы­шенную ломкость и значительно ухудшающие качество рез­ки материала. Для избавления от этих примесей свежий па­рафин следует на длительное время оставить в расплавлен­ном виде в плоских чашках (чтобы увеличить площадь для выделения газов) при температуре 70° (для этого можно приспособить сушильный шкаф). Можно также подвергать парафин частому расплавлению и нагреванию (до появле­ния дыма) с последующим быстрым охлаждением.

Если парафин, несмотря на соответствующую подготов­ку, сохраняет жесткость, к нему следует добавить чистый пчелиный воск в количестве от 2 до 5%, что придаст пара­фину большую эластичность.

Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий: 1) препарат должен быть полностью обезвожен и 2) не должен содер­жать спирт. Первое условие, как мы уже знаем, обеспе­чивается в процессе обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.

Удаление спирта. Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывают одним из растворителей парафина, обладающим способностью вы­теснять спирт. К таким веществам относятся: хлороформ, бензол, толуол, ксилол, сероуглерод и др. Чаще используют хлороформ и бензол. Толуол и ксилол делают кусочки бо­лее твердыми.

Следует помнить, что продажный разливной хло­роформ может быть загрязнен и содержать воду, что несовместимо с требованиями, предъявляемыми к веществам, применяющимся в процессе подготовки объекта к пропиты­ванию. Для освобождения хлороформа от спирта и воды его настаивают длительное время над хлористым кальцием. Хранят хлороформ в темноте, так как на свету он легко раз­лагается.

Методика пропитывания

Обезвоженные и уплотненные кусочки перекладывают из абсолютного спирта в смесь аб­солютного спирта с хлороформом (1:1) на 2-3 часа, а за­тем в чистый хлороформ, где они вначале плавают (высту­пая над его поверхностью), а затем по мере пропитывания постепенно погружаются. В процессе удаления спирта хло­роформ меняют 2-3 раза на протяжении 1,5-3 часов (в зависимости от свойств объекта и толщины кусочков). При величине кусочка 1 × 1 его держат в хлороформе 30 ми­нут. Затем, соблюдая принцип постепенного замещения хло­роформа парафином, помещают объект в смесь из равных частей парафина (желательно мягкого) и хлороформа. Эта смесь, застывающая при комнатной температуре, при на­гревании до 37° расплавляется и приобретает жидкую кон­систенцию. Кусочки находятся в хлороформ-парафине при 37° в течение 3-6 часов (при 56° время сокращают до 30 минут – 1 часа). При необходимости отсрочить дальнейш ую обработку материала можно после погружений объек­та в смесь хлороформа с парафином извлечь сосуд из тер­мостата и оставить при комнатной температуре на ночь (или даже на несколько дней) в закрытом состоянии, а затем, вновь расплавив в термостате при 56°, перенести в рядом стоящий горячий парафин для пропитывания, Излишнее пребывание объекта в растопленном хлороформ-парафине ухудшает качество резания.

В целях полного освобождения объекта от хлороформа кусочки проводят последовательно через 2-3 порции рас­плавленного парафина. Время пребывания в парафине за­висит от величины кусочков и свойств ткани. Кусочки тол­щиной 2-5 мм должны в общей сложности находиться в парафине от 2 до 5 часов.

Если объект хорошо обезвожен и не содержит спирта, задержка в парафине не ухудшает качество объекта даже при пропитывании в течение нескольких дней. При наличии же в кусочках остатков воды и спирта результаты обработ­ки ухудшаются прямо пропорционально длительности из­лишнего пребывания объекта в расплавленном парафине. Парафин для пропитывания можно применять многократ­но, но при этом нужно строго следить за тем, чтобы не пере­путать порции парафина. Для этого бюксы (или стакан­чики) необходимо обозначить соответствующими цифрами (1,2,3).

Заливка

После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально при­готовленным для этих целей и хранящемся в термостате.

В качестве формочек для заливки используют разнооб­разные приспособления.

Г-образные гладкие угольники (рис. 16, а) из металла (латунь, свинец, сталь). Рекомендуется приме­нять угольники, длинная сторона которых равна 8-10 см, короткая – 3 см, высота – 1,5-2 см. Угольники кладут на отполированную металлическую или стеклянную пластину и, сдвигая углы, создают формочку нужных размеров.

Бумажные коробочки изготовляют из листка плотной бумаги по схеме, представленной на рис. 16, б, где порядок номеров указывает очередность, а линии – направ­ление сгибания листка. Удобство бумажных формочек заключается в возможности значительного варьирова­ния их размеров, простоте маркировки (простым каран­дашом на стенках) и длительном хранении залитого ма­териала.

 

Рис.16. Приспособления для парафиновой заливки

а – г-образные металлические угольники,
б – приготовление формочки из бумаги.

 

Для заливки мелких объектов можно применять часо­вые стекла, четырехугольные фарфоровые ванночки из-под акварельной краски и другие приспо­собления.

Заливка осуществляется следующим образом. Пред­назначенный для заливки парафин подогревают до 58-60° и аккуратно наливают в приготовленную формочку, запол­няя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха (хорошо иметь для этих целей высокую фарфоро­вую кружку с ручко