Приготовление комбинированных парафиновых блоков

За последние годы в лабораторной практике находит применение способ одновременной заливки кусочков от не­скольких сравниваемых органов в единый блок. Для этого подлежащие совместной заливке объекты проводят по спир­товой батарее одновременно и на том этапе, когда необхо­димо придать кусочкам окончательную форму, обрезают их края так, чтобы в нужной комбинации они могли тесно прилегать друг к другу и в то же время имели бы различную форму, позволяющую определить принадлежность каждого отдельного объекта (рис. 17). После этого кусочки проводят вместе через промежуточные среды, парафины для пропитывания и укладывают в формочку для заливки в опреде­ленном порядке, стараясь сблизить края в процессе залив­ки.

Рис.17. Схема комбинированного блока, приготовленного из нескольких кусочков, одновременно залитых в парафин.

 

Схему расположения кусочков и их обозначение сразу же заносят в протокольную тетрадь. Подобные комбинированные блоки можно составлять и из уже залитых отдельно кусочков, придавим в твердом состоянии необходимую форму и поместив затем в горячий парафин, находящийся в термостате.

После полного расплавления парафина кусочки заливают вместе в единый блок. Из удачно залитого блока, содержащего 2, 3, 4 кусочка, можно приготовить хорошие, ровные срезы. Такие комбинированные срезы незаменимы при гистохимических исследованиях. Оценка гистохимической реакции ведется по интенсивности окраски исследуемых микроструктур, а это значит, что сравниваемые срезы должны иметь одинаковую толщину и находиться в равных условиях при проведении как самой гистохимической реакции, так и остальных этапов обработки препаратов. Все эти условия и обеспечиваются при данном способе. Помимо этого, значительно облегчается микроскопирование препаратов и создаются условия для одновременного изучения сравниваемых срезов в общем поле зрения (при малых увеличениях).

Приготовление гистологических препаратов из комбинированных блоков (конечно, когда это оправдано) имеет и ряд технико-экономических преимуществ, так как сокращает время резки и всех последующих этапов обработки срезов, а также потребление стекол, реактивов и других материалов прямо пропорционально количеству залитых кусочков.

В тех случаях, когда по условиям работы необходимо сократить время приготовления парафиновых блоков, можно применить ускоренную заливку. Для этого кусочек ткани толщиной 1,5-2 мм помещают в абсолютный (или 96°) спирт либо ацетон (с целью фиксации и обезвоживания) на 1-2 часа, производя при этом однократную смену фикса­тора.

Затем объект проводят в течение 1-1,5 часов через две смены чистого хлороформа (подогретого в термостате до 37°), перекладывают на 30-60 минут в смесь хлороформа с парафином (1:1), после чего пропитывают в парафине один, а затем другой раз (по 45-60 минут в каждом) и за­ливают. При таком режиме весь процесс от взятия мате­риала до заливки занимает 8-9 часов. Однако качество препарата ухудшается в основном в результате быстрого отнятия воды в спирте (или ацетоне). Поэтому применять этот метод нужно только в крайних случаях.

Наклейку блоков производят на деревянные кубики. Для этого из затвердевшего парафина скальпелем вырезают четырехугольный блок таким образом, чтобы объект со всех сторон был окружен слоем парафина толщиной 1-3 мм. Затем, положив на деревянный кубик небольшой кусочек твердого парафина, расплавляют его горячим металлическим шпателем (или скальпелем), проводят этим же шпателем по нижней поверхности парафинового блока и быстро придавливают его к кубику.

Заливка в целлоидин

Этот метод очень распространен в практике патолого-анатомических лабораторий, так как длительное пропитывание тканей и заливка их в среду без воздействия высокой температуры позволяет обеспечивать наилучшее сохранение микроструктур. Кроме того, при этом методе нет необходимости удалять из срезов заливочную среду.

Целлоидиновый способ также незаменим при исследовании легко расслаивающихся или деформирующихся материалов (стенка трахеи, целое глазное яблоко и др.). Недостатки метода – длительность процесса заливки, ограниченность времени хранения блоков и неудобство их содержания (в спирте), трудность получения тонких и серийных срезов.

В чистом виде целлоидин представляет собой вещество, растворимое в смеси спирта с эфиром. Для заливки приме­няют 2, 4 и 8% растворы целлоидина, которые необходимо приготовить заранее.

Исходным материалом может служить как готовый – продажный целлоидин в плитках, так и целлоидин, полученный из кино-, фото- и рентгеновской пленки. Нужно отметить, что не все сорта кинопленок годятся для этой цели. Годная к употреблению пленка должна быть растворимой в смеси абсолютного спирта и эфира.

Приготовление растворов целлоидина из кино- и рентгеновских пленок начинают с удаления эмульсионного слоя, для чего пленку на 20-30 минут помещают в теплую щелочную воду (10-15% содовый раствор) и затем моют жесткой щеткой до полного очищения от эмульсии. После этого пленку тщательно промывают в теплой воде, ополаскивают проточной холодной водой в течение нескольких часов и высушивают при комнатной температуре. Высушенную пленку нарезают в поперечном направлении ножницами на полоски шириной 5-10 мм и обезжиривают в хлороформе в течение 24 часов. Затем кусочки помещают на чистую фильтровальную бумагу и сушат 10-12 часов, предварительно накрыв листом бумаги.

Стандартный целлоидин также предварительно нарезают на мелкие кусочки (или натирают на обычной кухонной терке) и высушивают на фильтровальной бумаге при комнатной температуре до полного затвердения (предохраняя от запыления).

Приготовление растворов. Для того чтобы получить 500 мл раствора целлоидина, берут 10 г высушенного целлоидина, насыпают в плотно закрывающийся стеклянный сосуд, заливают 250 мл абсолютного спирта и оставляют на 24 часа, периодически взбалтывая (под действием спирта целлоидин набухает). Затем добавляют 250 мл безводного эфира, растворяющего разбухший целлоидин.

Таким же способом приготовляют 4 и 8% растворы. Приготовленные растворы нужно хранить в хорошо закрытых сосудах во избежание испарения жидкой среды и изменения концентрации раствора. Наилучшими для этих целей являются химические склянки с притертыми пробками и пришлифованными колпачками. Шлиф колпачка нужно смазывать вазелином. В таких сосудах растворы целлоидина могут сохраняться длительное время без изменения свойств.

Следует помнить, что эфир и сухой целлоидин очень огнеопасны, и при работе с ними принимать все меры предосторожности, предусмотренные для обращения с легковоспламеняющимися веществами.

Для приготовлений целлоидиновых растворов необходимо пользоваться только безводными спиртом и эфиром, ибо наличие хотя бы незначительного количества воды затрудняет пропитывание объекта и нарушает процесс уплотнения, что в свою очередь ухудшает качество блока. Так как эфир для наркоза не содержит воды, то он вполне пригоден для приготовления целлоидина. Технический эфир нередко загрязнен водой, спиртом и другими веществами, что требует его предварительной очистки. Для этого в сосуд с, эфиром засыпают гранулированный хлористый кальций (горсть на 1 л) и оставляют на 2-3 дня, затем осторожно отфильтровывают. Последнюю процедуру, если есть возможность, следует производить в вытяжном шкафу, закрывая воронку стеклянной крышкой во избежание испарения эфира (при этом нужно помнить о его легкой воспламеняемости). В отфильтрованный эфир добавляют металлический натрий (3-5 г на 500 мл) и закрывают пробкой, в которую вставлена стеклянная трубка, заполненная хлористым кальцием (для обеспечения выхода водорода и предотвращения попадания в сосуд паров воды из воздуха). Через 2 дня сосуд плотно закрывают обычной пробкой. В таком виде эфир может храниться длительное время.

Если нет уверенности, что эфир безводный, нужно провести пробу. В пробирку с 2-3 мл эфира добавляют такое же количество сероуглерода и взбалтывают. Появление мути свидетельствует о наличии воды.

Пропитывание объекта целлоидином – довольно длительная процедура. Вначале тщательно обезвоженный в абсолютном спирте материал помещают в смесь из равных частей безводного спирта с эфиром (растворитель целлоидина), затем его переносят в жидкий 2% раствор целлоидина, который последовательно по мере пропитывания заменяют более густыми 4 и 8% растворами. Длительность пропитывания прямо пропорциональна плотности тканей и толщине кусочков и варьирует от 2 (для неплотного объек­та толщиной 3-5 мм) до 6-7 дней в каждом растворе. По окончании пропитывания объект переносят в стеклянную чашечку с вертикальными стенками и плоским дном и заливают свежей порцией 8% раствора целлоидина с таким расчетом, чтобы после уменьшения объема заливочной среды вдвое (сгущение до 16% концентрации) над кусочком сохранялся слой целлоидина толщиной 2-3 мм. Более близкое расположение объекта к поверхности при водит к деформации препаратов за счет сил сжатия, возникающих в процессе сгущения раствора. Затем форму с залитым материалом ставят в эксикатор на сетку, а под нее помещают чашечку с хлороформом, в парах которого и происходит уплотнение целлоидина до необходимой консистенции. Для того чтобы установить время окончания этого процесса, на наружную стенку чашечки наклеивают бумажную полоску с отметкой начального и конечного (вдвое меньшего) уровня раствора целлоидина. Нужно избегать быстрого сгущения и регулировать процесс, периодически закрывая формочку крышкой. По окончании уплотнения на поверхность целлоидина наливают 70° спирт и оставляют на ночь. Затем вырезают залитый материал в виде прямоугольных кусочков таким образом, чтобы вокруг объекта сохранялся слой целлоидина толщиной 2-3 мм. Вырезанные кусочки можно хранить длительное время в 70° спирте как в виде наклеенных на деревянные кубики блоков, так и не наклеенными. В последнем случае каждый кусочек заворачивают в марлю, куда кладут бумажку с соответствующей надписью, сделанной простым карандашом.

Схематически весь процесс от фиксации объекта до приготовления блока выглядит следующим образом (при величине кусочка 1×1 см и более):

1. Промывать в проточной воде 24 часа.

2. Обезводить в спиртах восходящей крепости (включая две смены абсолютного спирта) – 12-24 часа в каждом спирте.

3. Поместить объект в смесь абсолютного спирта с эфиром (1:1) на 4-20 часов.

4. Перенести в жидкий 2% целлоидин на 2-6 дней.

5. Перенести в 4-6% целлоидин на 2-6 дней.

6. Перенести в густой 8-10% целлоидин на 2-7 дней.

7. Залить объект свежим целлоидином.

8. Уплотнить в парах хлороформа в эксикаторе.

9. Залить 70° спиртом, вырезать блоки и поместить их в 70° спирт для хранения.

Сроки каждого этапа подбирают опытным путем в зависимости от свойств исследуемого материала, размеров кусочков и качества целлоидина.

Существует способ заливки в целлоидин, при котором пропитывание производят в одном сосуде при постепенно повышающейся концентрации целлоидина (рис. 18). Для этого после пребывания мате­риала в двух сменах безводного спирт-эфира (1:1) его помещают в плотно закрывающийся широкогорлый сосуд, в который наливают известный объем (50 или 100 мл) свежего спирт-эфира.

Затем в мешочек из марли насыпают измельченный сухой целлоидин в таком количестве, чтобы при полном его растворении концентрация раствора равнялась 8-10% (5 г на 50 мл). Мешочек подвешивают за нитку так, чтобы только его нижняя поверхность омывалась спирт-эфиром, после чего сосуд плотно закрывают пробкой. Целлоидин постепенно: растворяется и непрерывно повышает концентрацию раствора. Срок пропитывания 4-10 дней. Если требуется ускорить растворение целлоидина, банку слегка наклоняют, если замедлить – приподнимают мешочек. По окончании пропитывания объект заливают обычным способом.

Следует знать, что быстрое появление на поверхности целлоидина плотной плёнки (во время сгущения) свидетельствует о наличии в целлоидине воды. При таких условиях уплотнение будет не равномерным и среда может помутнеть, что значительно ухудшает качество резки и окраски. Рекомендуется освободить материал от целлоидина (поместив в безводный спирт-эфир) и залить новой порцией безводного целлоидина.

Если в процессе сгущения в целлоидине появятся пузырьки воздуха, то нужно на его поверхность налить безводный спирт-эфир и прикрыть чашечку крышкой. Обычно после этого пузырьки выходят на поверхность сами, если же нет, то их удаляют препаровальной иглой. Правильно приготовленный целлоидиновый блок должен быть почти прозрачным и иметь консистенцию школьной резинки.

Если же по условиям работы необходимо сократить время приготовления целлоидинового блока, то можно применить метод ускоренной заливки. Для этого тонкие кусочки исследуемой ткани (толщиной не больше 2 мм) выдерживают в двух-трех сменах 96° (или абсолютного) спирта на протяжении 6-8 часов (общее время), после чего помещают на 12-16 часов в густой (10-12%) целлоидин. За тем вырезают блок, наклеивают на деревянный кубик, уплотняют под стеклянным колпаком (положив рядом кусочек ваты, смоченной хлороформом) в течение 1-1,5 часов. Хранят, как обычно, в 70° спирте.

Следует помнить, что качество срезов, приготовленных из таких блоков, значительно хуже, чем из блоков, залитых обычным способом. Применять метод ускоренной заливки нужно лишь в крайних случаях.

Наклейка целлоидиновых блоков. Деревянные кубики, предназначенные для наклейки целлоидиновых блоков, необходимо предварительно подвергнуть обработке с целью удаления из них экстрагируемых веществ. В противном случае эти вещества при хранении блоков в спирте переходят в раствор (или непосредственно в целлоидин), что значительно ухудшает качество блоков.

Наиболее распространенный способ заключается в следующем. Многократно кипятят деревянные кубики в течение нескольких дней (после каждого кипячения сменяют воду), затем несколько дней выдерживают в 70-80° спирте (или спирт-эфире), после чего тщательно высушивают.

Подлежащий наклейке целлоидиновый блок вынимают из спирта, промокают фильтровальной бумагой и помещают нижней поверхностью в смесь спирт-эфира (1:1) до начала растворения целлоидина (1-2 минуты). Затем на поверхность деревянного кубика (целесообразно сделать ее шероховатой) наносят скальпелем или шпателем несколько капель 12-16% целлоидина, в который погружают блок. При этом нужно избегать сильного придавливания блока, так как вытесняется жидкий целлоидин, и блок приклеивается непрочно. Наклеенные блоки через 5-10 минут кладут в широкогорлую банку с 70° спиртом, где они могут храниться длительное время. Предварительно их маркируют простым карандашом.

При длительном хранении блоков необходимо следить за цветом спирта и в случае появления желтоватой окраски производить замену свежей порцией, так как пребывание в желтом спирте ухудшает окраску препаратов.

Заливка в целлоидин - парафин

Этот метод сочетает в себе преимущества парафиновой и целлоидиновой заливок. Применять его рекомендуется при обработке:

1) нежных объектов, которые легко сжимаются при парафиновой заливке (мезенхимная ткань, органы кроветворений и др.);

2) органов, которые расслаиваются при резке в парафиновом блоке (трахея, кожа и др.).

Метод. Промывка и обезвоживание стандартные. Из безводного спирта материал помещают в смесь из равных частей спирта с эфиром (4-20 часов), а затем в 2% раствор целлоидина. После полного пропитывания (24-48 часов) объект переносят в чистый хлороформ, где он находится до тех пор, пока не погрузится под его поверхность (30 минут-1 час). Затем материал на такое же время переносят в свежую порцию хлороформа (время подбирают в зависимости от размера кусочков и свойства материала). После этого объект промокают фильтровальной бумагой и переносят в растопленную смесь хлороформа с парафином, в которой держат 20 минут при температуре 58° (после погружения кусочка сосуд можно оставить на столе до утра и даже на несколько дней). Последующее пропитывание и заливка, как при обычном парафиновом методе.

Существует модификация этого метода, согласно которой пропитывание материала ведется в смеси из равных частей 2% раствора целлоидина и касторового масла 1-3 дня. Затем объект переносят в хлороформ, который сменяют трижды через 1 час (для удаления касторового масла). Последующие этапы, как и при парафиновой заливке. Этот метод рекомендуется применять для заливки плот­ных тканей (кожа, трахея).

Заливка в желатину

Метод пригоден для эмбриологических исследований, заливки рыхлых тканей и органов (не вызывает сморщивания), при исследованиях с целью выявления жиров и липоидов. Режут желатиновый блок только на замораживающем микротоме.

Для заливки приготавливают два раствора: а) 25% раствор; 25 г размельченной или порошкообразной желатины растворяют в водяной бане (при 37°) в 75 мл 1 % карболовой воды (во избежание испарения сосуд должен быть закрыт); б) 12,5% раствор: 1 часть густого раствора разбавляют 1 частью теплой 1 % карболовой воды. Для приготовления последней в 100 мл дистиллированной воды растворяют 1 г карболовой кислоты при постоянном взбалтывании.

Приготовленные растворы желатины разливают в отдельные пробирки или другие небольшие сосуды порциями, пригодными для одной заливки (раствор используется однократно, так как повторное расплавление ухудшает застывание), и плотно закрывают пробкой.

Метод. Тщательно отмытый от фиксатора материал переносят для пропитывания сначала в жидкий (12,5%) раствор желатины на 3-20 часов (в зависимости от толщины и свойств объекта), затем на такой же срок в густой (25%) раствор (всю процедуру производят в термостате при 37°, в хорошо закрытых пробками баночках во избежание испарения воды и загустевания желатины, после чего заливают свежей порцией 25% раствора желатины), помещают в предварительно подогретые формочки и охлаждают в воде, внимательно следя, чтобы она не попала в желатину (летом воду следует предварительно остудить в холодильнике). После затвердения желатины из нее вырезают квадратные блоки, которые для уплотнения помещают на 24 часа в 20-25% раствор формалина и затем хранят в 10% растворе формалина.

Если уплотнение блока в формалине начинают слишком рано, то он делается скользким или ломким. Для удаления желатины из срезов их помещают в 10% раствор едкого кали (КОН) на 30 минут и держат в термостате 37-40°. Потом срезы основательно промывают в водопроводной воде и окрашивают. Полного удаления желатины из срезов при этом не достигается.