Окрашивание срезов гематоксилин-эозином

1. Депарафинировать в ксилоле - 2 мин.

2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).

3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.

4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).

5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.

6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.

7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).

8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.

9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.

10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.

Методика окрашивания гематоксилином
и эозином целлоидиновых срезов

1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.

2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.

3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.

4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.

5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.

6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.

7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.

Окрашивание срезов для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).

Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кри­сталлы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раство­ром гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта I и раствора Вейгерта II. Раствор Вейгерта I представляет собой 1% раствор

гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl₃, 6Н₂0). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, осо­бенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окра­шивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематокси­лин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллиро­ванную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депа­рафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повтор­ного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следу­ющий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллирован­ной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спир­тах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно устано­вить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окраши­вать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.

Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессив­ный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интен­сивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в кси­лоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

В качестве обзорной окраски можно рекомендовать также железный гематоксилин-пикрофуксин по Ван-Гизону.

Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окра­шивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифферен­цируются в пикрофуксине. Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллирован­ной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез филь­тровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается. Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро. В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашива­нии гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.

 

Вопросы для самопроверки

1. Определение гистологии как науки.
2. Объекты исследования гистологии.
3. Перечислите основные свойства микроскопического препарата.
4. Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата.
5. Какие группы красителей используют в гистологической практике?
6. Чем отличаются временные гистологические препараты от постоянных?
7. Объясните принцип работы на микротоме?
8. Техника приготовления тотальных препаратов.
9. Какие методы исследования применяют в цитологии и гистологии?
10. Типы микроскопов.
11. Сходства и различия в световой и электронной микроскопии? Разрешающая способность и увеличение.
12. Правила пользования и устройство светового биологического микроскопа.
13. Правила оформления лабораторной работы.
14. Техника приготовления гистологического препарата – окраска гематоксилин и эозином.
15. Дайте характеристику и классификацию фиксаторам.
16. Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
17. Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин.
18. Преимущества и недостатки четырёх способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, заливка в желатину; замораживание.
19. Для каких исследований применяют заливку в поливакс (карбовакс). Сущность этого метода.
20. Различные методы окраски гистологических срезов.
21. Методы окрашивания для обзорных целей.