Этапы апоптоза. Рецепторы, передача сигнала гибели клетки.

В развитии апоптоза можно выделить три стадии: индукторную, эффекторную и стадию деградации.
• В стадии индукции апоптоза происходит рецепция сигнала и начальные этапы его передачи.
• В эффекторной стадии активируются каспазы. Этот процесс вызывает необратимые изменения в клетке.
• В стадии деградации реализуются механизмы гибели клетки. Условно механизмы индукции апоптоза можно разделить на две группы:
• рецепторные (при действии внешних факторов на специализированные мембранные рецепторы);
• митохондриальные (при активации внутриклеточных сигналов).

Стадия I (индукция). Наиболее детально изучен рецепторный механизм индукции апоптоза при действии внешних факторов. Рецепторы, запускающие апоптоз, принадлежат к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли и обозначаются как рецепторы смерти (Death Receptor — DR). Характерная особенность этих рецепторов — наличие внутриклеточного домена, называемого доменом «смерти» (англ. Death Domain — DD), активация этого домена индуцирует внутриклеточные сигналы, приводящие к апоптозу. Описано 6 DR; среди них рецептор Fas (Аро-1 или CD95), ФНО-Р1 (р55 или СD120а) и другие рецепторы (TRAIL-R1/DR4, TRAIL-R2/DR5, Apo-2/TRICK2/KILLER, LTpR, CAR1 и DR6). Самые известные лиганды рецепторов смерти — Fas-лиганд (FasL или CD95L) и ФНО-сх. Они представляют собой мембранные белки, экспрессируемые теми же клетками, на которых находятся рецепторы, или клетками ближайшего окружения. Таким образом, апоптоз может индуцироваться по аутокринному или паракринному механизму. В последние годы показано, что не только рецепторы суперсемейства фактора некроза опухоли могут запускать процесс апоптоза — этой способностью обладают и TLR. Цитоплазматический домен TLR2 через каскад адапторных белков (MyD88 и FADD) активирует протеолитический каскад каспаз, что приводит к апоптозу клеток. Этот механизм показан для клеток плаценты. Активация TLR4 индуцирует синтез провоспалительного цитокина ФНО-а, который, связываясь со своим рецептором, запускает апоптоз. В макрофагах, инфицированных М. tuberculosis, тоже инициируется TLR-опосредованный апоптоз.

Внутренний путь активации апоптоза в основном связан с процессами, происходящими в митохондриях, и инициация апоптоза происходит с помощью внутриклеточных сигналов. К таким сигналам относят недостаток факторов роста, гормонов и цитокинов. Уменьшение количества этих факторов приводит к несостоятельности механизма супрессии апоптоза, и клетка запускает программу клеточной гибели. Радиация, гипоксия, гипотермия, вирусная инвазия и свободные радикалы непосредственно запускают внутренние механизмы апоптоза.

Все эти факторы приводят к изменениям на внутренней мембране митохондрий. Результат этих изменений — открытие пор в мембране митохондрий, потеря митохондриями мембранного потенциала и высвобождение из межмембранного пространства в цитозоль проапоптотических факторов.

Последний этап апоптоза — захват апоптотических клеток фагоцитами. Маркеры этой фазы — изменение структуры фосфолипидов и представление на поверхности мембраны фосфатидилсерина.

Клетки, подвергшиеся апоптозу, быстро фагоцитируются макрофагами. Рецепторы, участвующие в распознавании апоптотировавших клеток, включают рецепторы-«мусорщики», рецепторы витронектина, CD14 и др. При этом фагоциты секретируют противовоспалительные цитокины —ТФР и др. Неэффективное удаление апоптотировавших клеток способствует развитию аутоиммунных заболеваний, например СКВ.

122. Каспазы: образование и биологическая роль.

Оба пути активации апоптоза запускают каскад основных ферментов апоптоза — каспаз, принадлежащих к группе цистеиновых протеаз. На данный момент у человека описано 11 каспаз: 7 каспаз вовлечено в апоптоз, 3 — в активацию провоспалительных цитокинов и одна участвует в дифференцировке кератиноцитов.

В процессе апоптоза различные каспазы выполняют разные функции. В зависимости от того, на каком этапе эти белки вступают в каскад апоптоза, выделяют инициаторные и эффекторные каспазы. К инициаторным относят каспазы 8,9, 10 к эффекторным — каспазы 3, 7.

Механизм запуска неактивной каспазы можно рассмотреть на примере каспазы-8. В настоящее время предложен механизм созревания каспазы, представленный на рис. 6-2. При распознавании рецептором, запускающим апоптоз, своего лиганда внутриклеточный домен рецептора взаимодействует с адапторным белком FADD. Комплекс, образуемый при данном взаимодействии, получил название DISC (Death-Inducing Signalling Complex). Одна из молекул прокаспазы-8 связывается с комплексом DISC, что приводит к изменению конформации прокаспазы и ее взаимодействию с другой молекулой неактивной каспазы-8. Только димеризованная молекула каспазы-8 активируется и расщепляет прокаспазу-3. В отличие от инициаторных касапаз, механизмом активации которых служит димеризация, для активации эффекторной каспазы-3 необходимо ее протеолитическое расщепление. В активации каспазы-3 могут участвовать и другие инициаторные каспазы - 9 и 10.

Каспаза-3 специфически активирует эндонуклеазу CAD. В пролиферирующих клетках эта эндонуклеаза сопряжена с ее ингибитором — ICAD (англ. Inhibitor of Caspase Activated DNAse). В апоптотических клетках активная каспаза-3 разрезает ингибитор фермента, что высвобождает эндонуклеазу CAD. Активность фермента приводит к деградации хромосомальной ДНК, вызывая конденсацию хроматина.

Активация эндонуклеаз не единственная функция каспазы-3. Ферментативная активность каспазы приводит к реорганизации цитоскелета и преобразованию клетки в апоптотические тельца.

Все вышеописанные пути апоптоза обусловливают определенные, характерные для всех механизмов биохимические изменения. Каспазы обладают протеолитической активностью и способны расщеплять белки по остаткам аспарагиновой кислоты. Вследствие этой функции каспаз в клетке возникает одно из проявлений апоптоза — массивное разрушение белка. Другой признак апоптоза — активное перекрестное связывание пептидов. Это происходит из-за экспрессии и активации тканевой трансглутаминазы.

Деградацию ДНК осуществляют Са2+- и Mg2+-зависимые эндонуклеазы. В результате вся ДНК клетки распадается на фрагменты размером в 180-200 пар нуклеотидов. Важное биохимическое явление в процессе апоптоза — появление на поверхности апоптотической клетки маркеров, необходимых для ее фагоцитоза. Достигается это за счет перемещения молекул фосфатидилсерина на внешнюю поверхность клеточной мембраны. Фосфатидилсерин — один из основных лигандов для распознавания клетки-мишени фагоцитами. Однако не только фосфатидилсерин презентируется на поверхности клеточной мембраны. Также в течение апоптоза на поверхности клетки появляются такие белки, как аннексии V и калретикулин. Аннексии V — белок, связывающий фосфатидилсерин. Его часто используют как маркер апоптоза. Часто на мембране апоптотирующей клетки экспрессируется и адгезивный гликопротеин — тромбоспондин-1.

Варианты индукции апоптоза. Роль митохондрий в развитии апоптоза.

Индуцирующие апоптоз сигналы поступают в клетку через клеточные мембраны. Ряд веществ через взаимодействие с соответствующими рецепторами клеточной мембраны могут передавать негативный сигнал, блокирующий апоптоз (гормоны, факторы роста), другие — позитивный, индуцирующий апоптоз (Fas-лиганды, ФНО-α, ТФР-β). При этом отмена сигналов, блокирующих апоптоз, способна его индуцировать. Некоторые проапоптогенные факторы воздействуют сразу на внутриклеточные струтктуры. Например, глюкокортикоиды вызывают апопотоз клеток путём взаимодействия с соответствующими рецепторами, расположенными на ядерной мембране.

Наибольшое значение на внутриклеточной фазе передачи апоптогенного сигнала играют члены семействаbcl и bax генов, bcl-2 связывающий протеин (Apaf-1), семейство цистеиновых протеаз (каспаз), р53, Rb, c-vec,c-fos, c-jun. Члены семейства bcl-2 и bax, расположенные в митохондриях, регулируют проницаемость наружной митохондриальной мембраны и тем самым могут способствовать или препятствовать выходу из митохондрий цитохрома С, важнейшего триггера апоптоза. Члены семейства bcl-2 препятствуют апоптозу (ингибиторы апоптоза) и представлены следующими членами семейства: bcl-2, bcl-XL. Bcl-2 является аналогом ced 9 гена нематоды С. elegans. члены семейства, индуцирующие апоптоз, носят название промотор апоптоза, к ним относятся: bах, bаd. Все члены данного семейства способны взаимодействовать друг с другом и образовывать гетеродимеры, при этом наличие в составе гетеродимеров промоторов апоптоза является решающим в плане их функциональной активности. Гетеротермиды — промоторы апоптоза из bcl-2 семейства вызывают повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий и высвобождение цитохрома C, что считается одним из наиболее ранних событий апоптоза.

Высвободившись из митохондрий, цитохром C взаимодействует с проапоптозным фактором, активирующим протеазы (Apaf-1), аналогом гена ced 9 нематод, и тем самым индуцирует начало протеолитического каскада в клетке, определяющего её смерть. Протеолитические ферменты, участвующие в работе протеолитического каскада, могут быть подразделены на конролирующие, интегрирующие и представлены семейством протеаз, работающих как цистеиновые протеазы (cysteine, отсюда первая буква «к» в названии этих протеаз), способных расщеплять аспарагиновую кислоту («aspase»). Каспазы раделяют белки цитоскелетона и матрикса клетки, но основной целью их действия является ядро и ядерные белки, участвующие в транскрипции, репликации и репарации ДНК. В частности, каспаза 3 превращает неактивную форму цитоплазматической ДНКазы в активную, вызывающую внутринуклеосомальное расщепление ядерной ДНК.

Элиминация апоптозных телец осуществлятся путём фагоцитоза их неспециализированными фагоцитами (соседними клетками) и макрофагами. Процесс происходит настолько быстро, что наблюдать его в гистологических препаратах чрезвычайно сложно, а, кроме того, при этом не успевает развиться воспалительная реакция. Немедленный фагоцитоз обеспечивается особыми адгезивными свойствами апоптозных телец за счёт экспрессии на их мембранах определённых молекул, связывающихся с фосфатидилсериновыми и тромбоспондиновыми рецепторами и лектинами. Немедленный фагоцитоз апоптозных телец считается основным фактором блокирующим воспалительную реакцию на погибшие клетки. Таким образом, апоптоз совершается очень быстро, в среднем менее чем за 30 мин, и без воспалительной реакции. Апоптозные тельца могут удаляться также с секретом или лимфо- и кровотоком. Можно выделить три варианта нарушений регуляции апоптоза, обнаруживаемых при различных заболеваниях человека: чрезмерный апоптоз по сравнению с пролиферацией, недостаточный апоптоз по отношению к уровню пролиферативных процессов, незавершённый апоптоз в связи с отсутствием фагоцитоза апоптозных телец.