Основные правила поведения в бактериологической лаборатории

Основные правила поведения в бактериологической лаборатории

1. В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды: халата, тапочек, сменной обуви.

2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, запрещается курить и приносить пищу.

3. При распаковывании заразного материала необходимо соблюдать осторожность: пробирки снаружи обтирать дезинфицирующим раствором; переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, содержащим дезинфицирующий раствор.

4. Если разбилась посуда, содержащая заразный материал (пробирка, чашка Петри), немедленно производится обеззараживание предметов, одежды, стола и помещения.

5. После окончания работы дезинфицируют руки и поверхность рабочего стола.

6. Музейные культуры микробов ставят на хранение в холодильник, закрывают и опечатывают.

7. Работники лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, с возбудителями которых они работают. На кафедре микробиологии используются материалы, содержащие возбудителей ΙΙΙ-ΙV групп, после разрешения председателя режимной комиссии Республиканской СЭС.

 

 

Правила забора материала для микробиологических исследований

При заборе и работе с клиническим материалом персонал должен использовать перчатки и халат. Сроки доставки клинического материала в лабораторию должны быть сокращены до минимума.

Кровь для посева следует брать до начала антибактериальной терапии; на высоте подъема температуры; у постели больного с соблюдением правил асептики. Посев производится в двойную и тиогликолевую среду в соотношении 1:10.

Моча для посева берется до начала антибактериальной терапии. Моча здорового человека стерильна. От начала взятия пробы мочи до начала исследования в лаборатории должно проходить не более 1-2 часов.

Гной получают с помощью стерильного шприца или стерильного ватного тампона.

Испражнения на патогенные энтеробактерии берут ректальными петлями, смоченными консервантом, и помещают в пробирку с консервирующей средой.

Слизь из носоглотки (на дифтерию) забирают стерильным тампоном натощак. Тампон помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию не позже 2-3 часов с момента забора материала.

Спинно-мозговую жидкость получают в результате люмбальной пункции. 3-5 мл ликвора помещают в пробирку (при транспортировке предохранять от охлаждения).

Мокроту собирают натощак после ополаскивания рта в стерильную посуду.

Правила забора материала, хранения и транспортировки при ООИ.

К особо опасным инфекциям прежде всего относится чума. При постановке предварительного диагноза «чума» в лаборатории проводятся срочные мероприятия:

1. Немедленно сообщают в вышестоящие органы здравоохранения.

2. На лабораторию накладывается карантин, т.е. ни один лабораторный работник, контактировавший с заразным материалом, не должен покидать помещения лаборатории до прибытия эпидемиолога.

3. Все материалы: от больных, чистые культуры и павшие животные должны быть направлены в специализированные лаборатории для окончательного установления диагноза.

 

Меры безопасности при транспортировке

Материал помещают в банки с плотно закрывающейся пробкой, обвязывают пергаментом (т.е. водонепроницаемым материалом), затем обвертывают салфетками, смоченными 5% раствором лизола или фенола. В таком виде банки с материалом помещают в металлические биксы. На банки с материалом наклеивают этикетки. Все надписи на этикетке делают простым графитным карандашом, т.к. надписи чернилами смываются при дезинфекционной обработке.

4. После отправки материала проводят заключительную дезинфекцию.

Культуру автоклавируют при температуре 120⁰ С в течении 1 часа. Стеклянную лабораторную посуду обеззараживают в 3% растворе хлорамина или карболовой кислоты 1 сутки, а затем кипятят в 1% растворе бикарбоната натрия.

Трупы животных автоклавируют, заливают 10% раствором лизола на сутки и закапывают в специально вырытую яму.

Кожу открытых частей тела обрабатывают 70% раствором спирта.

 

 

Составить направление на микробиологическое исследование

 

Направление на исследование является сопроводительным документом, который прилагается к инфекционному материалу, предназначенному для лабораторных исследований.

Составляется по следующей форме:

1. название материала

2. учреждение, направляющее материал

3. фамилия, имя, отчество больного

4. возраст

5. адрес больного

6. дата заболевания

7. дата взятия материала

8. предполагаемый клинический диагноз

9. подпись врача, направляющего материал

Поступивший в лабораторию инфекционный материал регистрируется в специальном журнале.

 

 

Дезинфекция в микробиологической лаборатории

Дезинфекция- это обеззараживание объектов окружающей среды с помощью химических веществ, обладающих антимикробным действием.

Цель дезинфекции -предупредить передачу возбудителей от инфицированного организма неинфицированному.

В микробиологической лаборатории используют:

1. хлорную известь (0,1-10% раствор);

2. хлорамин (0,5-5% раствор), для дезинфекции рук 0,25-0,5% раствор, для дезинфекции предметов ухода за больными при кишечных и воздушно-капельных инфекциях 1-3% раствор, при туберкулезе-5% раствор;

3. фенол (карболовая кислота) в виде 3-5% раствора для дезинфекции помещений;

4. лизол (3-5% раствор);

5. биглюконат хлоргексидина (гибитан), для дезинфекции рук 0,5% раствор, для дезинфекции помещений 0,1% раствор;

6. дихлорид ртути (сулема)-иногда используют для дезинфекции предметов ухода за больными. Препарат высокотоксичен, всасывается через кожу.

 

 

Подготовка посуды к стерилизации

В бактериологических и вирусологических лабораториях используют обычную лабораторную посуду: цилиндры, колбы, склянки для растворения и хранения реактивов, химические пробирки. Помимо этого специальную посуду:

Пробирки

- биологические- с крупным дном, неразвернутым краем;

- центрифужные- сужены книзу, конической формы;

- преципитационные- очень узкие с внутренним диаметром 2-3 мм

Стеклянные чашки Петри для выращивания микроорганизмов на плотных питательных средах. Их изготавливают из прозрачного стекла, не имеющего камней, пузырей. Высота чашки 20-30 мм, диаметр 60-200 мм.

Пипетки

- градуированные должны соответствовать параметрам ГОСТа

- пастеровские- стеклянные трубки диаметром 5-7 мм, у которых один конец оттянут над пламенем горелки в виде капилляра.

Специальная лабораторная посуда должна быть чистой и стерильной. Мытье производят ершами с мылом и содой. Новую посуду следует до мытья прокипятить в 1-2% растворе хлористоводородной кислоты. Сушат посуду в сушильном шкафу.

Сухую посуду закрывают и помещают в пеналы. В пробирки вставляют ватные пробки и заворачивают в пачки по 5-10 штук. К чашкам Петри подбирают крышки и завертывают по одной или несколько штук.

Пипетки закрывают ваткой с того конца, который берут в руки. Готовые пипетки заворачивают в бумагу и укладывают в пеналы.

Стерилизация проводится в сухожировом шкафу при температуре 180⁰С в течение 1 часа.

 

 

Этапы приготовления мазка.

Для приготовления мазка необходимо иметь:

· Чистое обезжиренное предметное стекло.

· Бактериологическую петлю.

· Культуру, выращенную на плотной питательной среде- агаре, или жидкой –бульоне.

· Спиртовку.

· Набор красок.

1. Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Петлю берут правой рукой, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони.

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры наносят петлей на предметное стекло.

Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал.

Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым, округлой формы, размером 1,5-2см².

2. Высушивание мазка производится при комнатной температуре.

3. Фиксация мазка производится с целью:

· Убить микробные клетки.

· Обеспечить лучшее прилипание микробов к предметному стеклу.

· Обеспечить дальнейшее окрашивание.

Фиксация мазка в пламени горелки производится 3-кратно, действие пламени должно длится 2 секунды.

Для более нежной фиксации мазков крови, спирохет и простейших используют химические фиксаторы:

· Метиловый спирт в течении 5-и минут.

· Этиловый спирт (96⁰) в течении 10-и минут.

· Смесь Никифорова – в течении 10-15 минут.

· Ацетон – в течении 5-и минут.

· Пары формалина – в течении нескольких секунд.

4. Окраска препаратов проводится:

· Простыми методами (водным фуксином Пфейффера, метиленовой синькой Леффлера), когда окрашивается вся клетка и используется только один краситель;

· Сложными методам, когда определяются клеточные структуры.

После экспозиции мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

 

 

Метод «раздавленной капли».

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли».

Необходимо иметь предметное стекло с луночкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с луночкой посередине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

 

 

Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ)

Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение часа, после чего остужают, фильтруют, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1 атм. 30 минут.

Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины.

Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят, устанавливают рН 20% раствором едкого натра.

Приготовление мясо-пептонного агара (МПА)

К мясо-пептонному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100⁰С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо-пептонный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20^о.

 

 

Окраска мазка по Граму.

Метод Грама введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Христианом Грамом и является важным таксономическим признаком.

К грамположительным бактериям относятся те, у которых комплекс, образуемый генцианвиолетом и йодом, удерживается при обработке спиртом.

Грамотрицательными называют те бактерии, которые не обладают свойством удерживать комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом.

Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианвеолета с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Методика окраски.

 

1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 минуты.	Генцианвиолет основная краска.
2. Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту.	Раствор Люголя протрава: усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.
3. Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течение 30секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски.	Спирт обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой.
5. Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течение 1-2 минут.	Водный фуксин дополнительная краска.	Грамположитель- ные бактерии (кокки) сине-фиолетового цвета, грамотрицательные (палочковидные формы) розового цвета.
6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

 

Подготовка и учет объемной РА.

а) реакция Видаля

Реакция агглютинации широко применяется в лабораторной практике для серодиагностики. Реакция агглютинации протекает в две фазы:

1 фаза – соединение антигена с антителом;

2 фаза – адсорбция на комплексе антиген+антитело физиологического раствора и выпадение осадка двух видов:

а) крупнохлопчатого – у жгутиковых бактерий (Н-агглютинация);

б) мелкозернистого – агглютинат образуется в виде компактных зерен (О-агглютинация).

Компоненты реакции Видаля:

1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600;

2) диагностикумы – взвесь убитых сальмонелл трех видов: брюшного тифа, паратифа А и В;

3) физиологический раствор.

Цель реакции: определение титра антител в испытуемой сыворотке.

Реакция агглютинации должна сопровождаться контролем антигена и сыворотки. Реакция ставится в трех рядах. Учет результатов проводят через 18-20 часов.

Степень положительной реакции агглютинации обозначается плюсами:

+ + + + полная агглютинация

+ + + неполная агглютинация

+ + слабая агглютинация

- осадка нет (отрицательная реакция)

б) реакция Вейгля

Ставится с 8 дня болезни при сыпном тифе и болезни Брилля-Цинссера для обнаружения антител в испытуемой сыворотке крови.

Компоненты реакции Вейгля:

1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800; 2) риккетсиозный диагностикум – взвесь убитых риккетсий Провачека

3) физиологический раствор

Реакция применяется при рецидивах эпидемического сыпного тифа (болезни Брилля-Цинссера), обусловленных реактивацией риккетсий Провачека в сыпнотифозных гранулемах.

 

Реакция фаголизиса.

Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии.

Постановка реакции:

1) чистая культура шигелл на скошенном агаре;

2) 2 пробирки с МПБ – «опыт» и «контроль»;

3) дизентерийный бактериофаг

На I этапе:

1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму);

2) Посев в 2 пробирки с МПБ

3) В пробирку «опыт» добавить 2 капли (0,1 мл) дизентерийного бактериофага;

4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37^оС

На II этапе:

1) Регистрация результатов посева

В пробирке «контроль» имеется равномерное помутнение МПБ, т.к. культура шигелл оказалась жизнеспособной. В пробирке «опыт» МПБ прозрачный, т.е. дизентерийный бактериофаг вызвал лизис одноименной культуры бактерий.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

При ИФА в качестве метки применяют ферменты. Используется в диагностике СПИДа и вирусных гепатитов. Иммуноферментная система «Гепа Стрип» предназначена для выявления поверхностного HbsAg антигена вируса гепатита В.

Компоненты:

1. Полистироловый планшет;

2. Антитела к HbsAg;

3. Конъюгат – мышиные моноклониальные антитела, меченые пероксидазой;

4. Контрольные сыворотки;

5. Фосфатно-солевой буфер;

6. Ортофенилдиамин (ОФД).

Реакция протекает в две фазы. HbsAg связывается с гомологичными антителами, меченными пероксидазой. Затем ставят цветную реакцию с использованием ОФД, происходит желтое окрашивание.

Учет ИФА – по оптической плотности с помощью фотометра, при этом степень оптической плотности будет обратно пропорциональна концентрации HbsAg антигена вируса гепатита В.

 

Реакция флокуляции

Протекает in vitro (в пробирке) при эквивалентном соотношении антигена и антитела. Сопровождается помутнением и выпадением осадка. Феномен флокуляции используют:

- для определения флоккулирующей активности токсинов;

- для титрования антитоксических сывороток.

Например, при дифтерии используется реакция флокуляции с дифтерийным анатоксином. В пробирке, где количество сыворотки и анатоксина эквивалентно, выпадают нежные хлопья. Количество анатоксина, дающее в смеси 1 АЕ сыворотки инициальную флокуляцию, называется 1 иммуногенной единицей анатоксина (1 ИЕ).

 

Опсоно-фагоцитарная реакция

Относится к непрямым односистемным реакциям.

Механизм: усиление фагоцитоза микробных клеток под влиянием содружественного воздействия антител, иммунной сыворотки и комплемента.

Компоненты реакции:

1) антиген – суточная микробная культура;

2) испытуемая сыворотка больного;

3) комплемент – свежая сыворотка морской свинки;

4) фагоциты – лейкоцитарная взвесь.

Опсонины – это антитела, которые содержатся в нормальных и иммунных сыворотках и подготавливают микробы к фагоцитозу.

Реакция ставится в специальных пробирках при t=37^оС в течение 30 минут. Затем из каждой пробирки готовят мазки, считают под микроскопом 100 фагоцитов и определяют число фагоцитированных микробов в опыте и контроле.

Опсонический индекс = фагоцитарный показатель иммунной сыворотки / фагоцитарный показатель нормальной сыворотки

Чем выше опсонический индекс (должен быть >1), тем активнее исследуемая сыворотка, и, следовательно, тем выше иммунитет (при бруцеллезе).

 

 

Методические рекомендации для студентов к освоению практических навыков по микробиологии

 

Составители:

 

Габидуллин З.Г.

Булгаков А.К.

Савченко Т.А.

Давлетшина Д.Т.

Нигматуллина Г.Н.

Гашимова Д.Т.

Ахтариева А.А.

 

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г.

Подписано к печати 22.10.05

Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе.

Формат 60х84 ¹/₁₆. Усл.-печ. Л 1,3. Уч.-изд.1,7.

Тираж экз. Заказ №.

 

 

450000, г.Уфа, ул.Ленина, 3

Башкирский государственный медицинский университет

Основные правила поведения в бактериологической лаборатории

1. В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды: халата, тапочек, сменной обуви.

2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, запрещается курить и приносить пищу.

3. При распаковывании заразного материала необходимо соблюдать осторожность: пробирки снаружи обтирать дезинфицирующим раствором; переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, содержащим дезинфицирующий раствор.

4. Если разбилась посуда, содержащая заразный материал (пробирка, чашка Петри), немедленно производится обеззараживание предметов, одежды, стола и помещения.

5. После окончания работы дезинфицируют руки и поверхность рабочего стола.

6. Музейные культуры микробов ставят на хранение в холодильник, закрывают и опечатывают.

7. Работники лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, с возбудителями которых они работают. На кафедре микробиологии используются материалы, содержащие возбудителей ΙΙΙ-ΙV групп, после разрешения председателя режимной комиссии Республиканской СЭС.