Правила работы с микроскопом.

ИНСТРУКЦИИ

К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ

по учебной дисциплине «Микробиология»

 

 

 

Молодечно, 2015

 

Разработчик: Устинова С.В., заведующая лабораторией «Микробиология продукции пищевых производств» учреждения образования «Молодечненский государственный политехнический колледж».

 

 

Лабораторная работа № 1

Тема: Изучение устройства микроскопа, техники микроскопирования. Приготовление препаратов из различных культур микроорганизмов. Изучение морфологических признаков бактерий.

Цель: 1. Ознакомление с оборудованием микробиологической лаборатории.

2. Изучить устройство микроскопа и правила работы с ним.

3. Изучить форму клеток бактерий.

Необходимые материалы: масло иммерсионное, микроскоп, предметные стёкла, покровные стёкла, бактериологимеская петля, стеклянные палочки, вата, водно-спитовая смесь, среды, содержащие бактерии.

 

Устройство микроскопа.

Для изучения и исследования микроорганизмов предназначен микроскоп. Это оптический прибор, с помощью которого можно получить определённое увеличение исследуемого объекта.

Микроскоп состоит из трёх частей:

1) оптическая; 2) осветительная; 3) механическая;

Оптическая часть состоит из оптических линз, и предназначена для получения увеличения микроскопических объектов. В состав оптической части входят:

- бинокулярная насадка, окуляры которой могут давать увеличение в 7, 10 или 15 раз;

- четыре объектива: с увеличением в 4 раза, для плесневых грибов – в 10 раз, для дрожжей - в 40 и 100 раз, для бактерий – в 100 раз.

Осветительная часть предназначена для освещения исследуемого объекта. Она состоит из источника света, встроенного в основание штатива, и конденсора, предназначенного для более полного освещения микроскопического объекта.

Механическая часть состоит из основания и штатива микроскопа, револьверного устройства, предметного столика, фокусировочных механизмов. Грубое перемещение осуществляется рукояткой механизма грубой фокусировки (макровинт), расположенной с левой стороны штатива, точное перемещение – рукоятками механизма микрометрической фокусировки (микровинт), расположенными с обеих сторон штатива. С помощью макровинта находится изображение, а с помощью микровинтов регулируется резкость и четкость изображения.

Исследуемые препараты помещают на предметный столик, закрепляя их между держателем и прижимом препаратоводителя, для этого прижим отводиться в сторону. Предметный столик перемещается рукоятками, расположенными с левой стороны, в продольном и поперечном направлении.

Четырехгнездное револьверное устройство обеспечивает установку объективов в рабочее положение. Смена объективов производиться вращением рифленого кольца револьверного устройства до фиксированного положения.

Практическая часть работы.

Изучив устройство микроскопа, нужно научиться с ним работать и освоить методику приготовления микроскопических препаратов. Все рассмотренные препараты нужно зарисовать.

Под морфологическими признаками понимают строения клетки, размеры, форму клетки микроорганизмов, спорообразование, подвижность.

В условиях лаборатории можно определить морфологию картофельной и сенной палочки, молочно-кислых бактерий, гнилостных бактерий. Для этого необходимо вырастить различного вида бактерии. Для определения сенной палочки делают настой сена и готовят препарат, рассматривают под микроскопом. Молочно-кислые бактерии можно увидеть в капустном, огуречном и других рассолах/

1. Препарат живых клеток "раздавленная капля".

Если организмы находятся в жидкой среде на обезжиренное предметное стекло поместить каплю живых клеток бактерий и притереть покровным стеклом, для чего покровное стекло ставят сначала на предметное одним ребром, а затем плавно опускают, прижимая «раздавливая» при этом каплю.

Если культура выращена на твердой питательной среде, то на стекло предварительно наносят каплю воды, а затем помещают в неё клетки микроорганизмов бактериологической петлёй, прокалённой в пламени горелки, и тщательно размешивают. Не следует вносить много исследуемого материала, капля должна быть лишь слегка мутной. Материал, оставшийся на петле, сразу же сжигают в пламени горелки.

На поверхность покровного стекла наносят каплю иммерсионного масла и, погрузив в него объектив с увеличением в 100 раз, находят изображение.

 

Лабораторная работа № 2.

Тема: Изучение морфологических признаков плесневых грибов и дрожжей.

Цель: Изучение строения тела грибов и возможностей отличия их друг от друга, изучения формы дрожжевой клетки.

Материальное обеспечение: микроскопы, чашки Петри с выращенными микроорганизмами, реактивы.

Плесневые грибы — это чаще всего многоклеточные микроорганизмы, достигающие размеров нескольких миллиметров и видимых простым глазом.

Однако исследование плесневых грибов возможно только с помощью микроскопа. Выращивают плесневые грибы обычно на поверхности питательных сред, т. к. они растут с обязательным доступом воздуха. В условиях лаборатории их выращивают в чашках Петри на плотных питательных средах. Чашку Петри с выращенными грибами помещают на столик микроскопа и, используя объектив с увеличением в 10 и 40 раз, изучают плесневые грибы. В микроскоп можно увидеть непосредственно грибницу, воздушные гифы и плодовые тела.

По форме плодовых тел можно определить вид плесневых грибов. Кроме того каждый гриб даёт характерные колонии при выращивании, отличающиеся чаще всего цветом, что является дополнительным фактором для развития различных видов плесневых грибов.

В условиях лаборатории чаще всего растут мукоровые грибы, пеницилловые, аспергилловые грибы и др.

Мукоровые грибы — образуют на поверхности питательных сред серый ватообразный налёт, а при рассмотрении под микроскопом видны характерные шаровидные вздутия чёрного цвета (спорангии), в которых находятся органы размножения (спорангиеспоры).

При обнаружении данного вида гриба можно сделать рисунок, определить к какому классу грибов он относится и дать его практическое применение.

Пеницилловые грибы — на поверхности питательных сред образую колонии зелёного цвета. В микроскопе напоминают короткие кисти, состоящие из органов размножения (конидий). Нужно рассматривать край колонии, иначе рисунок будет густым и его будет трудно рассматривать.

 

 

Род Oidium (кл. Дейтеромицеты) характеризуетсяналичием сильно разветвленного мицелия, гифы которого легко расспадаются на оидии – отдельные клетки, служащие для бесполого размножения. Характерным представителем является молочная плесень, часто встречается в виде бархатистой пленки на поверхности кисломолочных продуктов, вызывая их порчу.

 

 

Ход работы:

Изучение плесневых грибов.

Чашку Петри с выращенными грибами помещают на столик микроскопа и с помощью объектива с увеличением в 10 раз находим изображение.

 

Изучение дрожжей.

Для изучения морфологии дрожжей из дрожжевой суспензии готовим препарат «раздавленная капля» и рассматриваем форму дрожжевой клетки. Для рассмотрения можно использовать хлебопекарные дрожжи.

Все рассматриваемые препараты нужно зарисовать и сделать необходимые пояснения и выводы к ним.

Дрожжевые клетки содержат запасное азотистое вещество метахроматин (волютин), который содержится в клетках в форме полужидких зёрен. Для их обнаружения препарат фиксируют, окрашивают в течение 0,5-1 мин. карболовым фуксином Циля. Сливают краситель, промывают водой и обесцвечивают препарат 1% раствором серной кислоты в течении 20-30 сек. Сливают кислоту, препарат промывают водой и окрашивают слабым раствором метиленового синего (1:40) в течении 1-2 мин. При окрашивании метахроматин в клетках приобретает красный цвет, а протоплазма - синий.

Включения жира встречаются в клетках многих микроорганизмов. Их легко обнаружить при окраске клеток Суданом III. Для этого каплю культуры на предметном стекле смешивают с каплей краски. При исследовании под микроскопом, протоплазма клеток будет бесцветной, а капля жира окрашенной в красный цвет.

Микроскопируют препараты с сухой или иммерсионной системой.

После проведения опытов необходимо сделать выводы по работе.

 

Вопросы для самопроверки:

 

1.Опишите метод определения метахроматина?

2.Почему дрожжи называются сахарными грибами?

3.Основное свойство дрожжей?

4.Объсните назначение плодовых тел?

5.Укажите основные отличия в строении пенициловых и аспергиловых грибов?

6.Какую роль могут играть мицелиальные грибы в пищевых производствах?

Лабораторная работа № 3.

Тема: Приготовление питательных сред. Выполнение посевов и пересевов микрoорганизмов

Цель: 1. Изучить методику приготовления питательных сред.

2. Приобретение практических навыков по технике посевов и пересевов микрoорганизмов

Материальное обеспечение:

1. Картофель. 2. Капуста. 3. Молоко. 4. Глюкоза. 5.Пентон. 6.Соляная кислота. 7.Желатин. 8. Сахар. 9. Сухие питательные среды заводского приготовления. 10. Пробирки. 11. Фильтровальная бумага. 12. Весы технические. 13. Конические колбы на 200см³, 14. Вата. 15. Чашка Петри. 16. Автоклав. 17. Спиртовки. 18. Фосфорнокислый калий. 19. Сернокислый магний. 20. Марля.

21. Универсальная индикаторная бумага.

Ход работы

Техника посевов и пересевов

Посевом называют внесения в стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для культивирования микрoорганизмов.

Пересевом называют перенос выращенных микрoорганизмов в стерильную среду. Пересевы производят так, чтобы в питательную среду не попали из воздуха или с поверхности окружающих предметов посторонние микрoорганизмы. Пересевы часто делают для поддержания чистых культур микрoорганизмов в чистом виде долгое время.

 

Произвести следующие посевы

2.1. Посев уколом (для внесения анаэробов). Посев производится длиной иглой в столбик МПА или желатина питательного. Для этого пробирку переворачивают кверху дном и иглой с посевным материалом прокалывают столбик среды снизу до самого дна. Пробирку закрывают обожженной ватной пробкой.

2.2. В стерильную чашку Петри стерильной пипеткой вливают 1 см³ посевного материала, заливают стерильной питательной средой расплавленной и охлажденной до

48-50^о С. Закрывают крышкой, размешивают круговыми движениями по столу.

 

2.3. Посев на поверхность застывшей среды произвести при помощи шпателя, а на МПА в пробирке микробиологической петлей.

 

Техника пересевов

1. Посевы производят вблизи пламени горелки, в пламени которой стерилизуют петли, ватные тампоны, пробирки, края пробирок.

2. В левую руку берут одну пробирку с пересеваемой культурой, другую - с питательной средой и держат в наклонном положении между указательным и большим пальцем.

3. Петли держат в вертикальном положении над пламенем горелки и прокалывают докрасна.

4. Достают ватные пробки, держат их безымянным пальцем и мизинцем правой руки

5. Обжигают края пробирок

6. Внося петлю в пробирку с пересеваемой культурой, захватывают небольшое число микрoорганизмов, стараясь не зацепить стенок, перенося во вторую пробирку со стерильной питательной средой.

7. Петлю вынимают, обжигая края и внутренние концы пробирок. Если пробка загорится, то ею закрывают пробирку, а наружный конец гасят рукой или пинцетом.

8. Петли вновь обжигают в пламени, на пробирке делают соответствующие записи: название культуры, дату пересевов.

В конце работы учащиеся должны отметить, какие питательные среды они приготовили, какие выполнили посевы и пересевы.

Лабораторная работа №5

Тема: Санитарно – бактериологический анализ проб воздуха, воды.

Цель: 1. Приобретение навыков микробиологического контроля

2. Углубление знаний по роли микроорганизмов в пищевых производствах.

Материальное обеспечение: стерильные колбы,микроскопы, чашки Петри, предметные и покровные стёкла, стерильная среда МПА.

 

При подготовке необходимо ответить на следующие вопросы:

1. Понятие «микрофлора» воды.

2. Необходимость контроля воздуха и воды.

3. Правила приготовления препаратов и плотных питательных сред.

4. Будет ли отличаться микрофлора воздуха и воды по своему составу.

 

Посев воды.

При исследовании водопроводной воды обжигают кран в пламени горящего ватного тампона, смоченного спиртом. Открывают кран и спускают воду 10 мин. Наливают воду в стерильную колбу с ватной пробкой. Отбирают стерильной пипеткой 1 см³, выливают в чашку Петри и заливают охлажденным до 45^оС мясопептонным агаром. Чашки закрывают и, когда среда застынет, их переворачивают вверх дном, и ставят в термостат для выращивания на 48 час. при Т=37^оС.

 

Метод оседания

В стерильные чашки Петри с соблюдением правил асептики вливают 20 мл расплавленного МПА. Закрывают чашку и ждут, когда застынет среда. Чашку ставят на бумагу, приоткрывают ее. Крышку держат открытой 5-10-15 мин., в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения.

Аспирационный метод

Аспирационнный метод осуществляют с помощью портативного пробоотборника воздуха. Механизм улавливания микрофлоры основывается на ударно-прибивном действии струй воздуха, которые проходят через отверстия крышки-рассекателя и с большой скоростью ударяются о влажную поверхность питательной среды. Во время отбора пробы воздуха чашка Петри вращается вместе со столиком, благодаря чему достигается равномерное обсеменение поверхности питательной среды микрофлорой воздуха. Для отбора проб следует подбирать чашки Петри с плоским дном, а количество питательной среды в чашке не должно превышать 15 мл.

После пробоотбора воздуха чашки Петри закрывают и ставят в термостат для культивироваия на 48 час. при t=37^оС

 

Анализ посевов воды

1.1 Провести подсчет выросших колоний и сделать вывод о соответствии воды требованиям СанПиНа.

1.2 Изучить наиболее характерные колонии под микроскопом, приготовив препарат «раздавленная капля»

 

Анализ посевов воздуха.

2.1 Провести микробиологический анализ выросших колоний микроорганизмов (определить какие группы микроорганизмов преимущественно выросли на данной питательной среде).

2.2 Подсчитать количество выросших колоний на поверхности питательной среды и рассчитать содержание микроорганизмов в 1 м³ воздуха (микробное число) по формуле:

 

где: а - количество выросших колоний в чашке Петри;

100 – пересчет площади чашки на 100 см² на площадь, на кото рую происходит оседание, см²;

1000 – объем воздуха, л;

5 – время экспозиции, мин.;

S - площадь чашки Петри, см²

Т – время, в течение которого чашка была открыта, мин

10 – объем воздуха из которого происходит оседание микробов за 5 мин., л.

 

Площадь чашки Петри в зависимости от диаметра:

Диаметр, см	Площадь, см^2
	78,5

 

2.3 Рассмотреть некоторые колонии под микроскопом, приготовив препарат «раздавленная капля»

 

ИНСТРУКЦИИ

К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ

по учебной дисциплине «Микробиология»

 

 

 

Молодечно, 2015

 

Разработчик: Устинова С.В., заведующая лабораторией «Микробиология продукции пищевых производств» учреждения образования «Молодечненский государственный политехнический колледж».

 

 

Лабораторная работа № 1

Тема: Изучение устройства микроскопа, техники микроскопирования. Приготовление препаратов из различных культур микроорганизмов. Изучение морфологических признаков бактерий.

Цель: 1. Ознакомление с оборудованием микробиологической лаборатории.

2. Изучить устройство микроскопа и правила работы с ним.

3. Изучить форму клеток бактерий.

Необходимые материалы: масло иммерсионное, микроскоп, предметные стёкла, покровные стёкла, бактериологимеская петля, стеклянные палочки, вата, водно-спитовая смесь, среды, содержащие бактерии.

 

Устройство микроскопа.

Для изучения и исследования микроорганизмов предназначен микроскоп. Это оптический прибор, с помощью которого можно получить определённое увеличение исследуемого объекта.

Микроскоп состоит из трёх частей:

1) оптическая; 2) осветительная; 3) механическая;

Оптическая часть состоит из оптических линз, и предназначена для получения увеличения микроскопических объектов. В состав оптической части входят:

- бинокулярная насадка, окуляры которой могут давать увеличение в 7, 10 или 15 раз;

- четыре объектива: с увеличением в 4 раза, для плесневых грибов – в 10 раз, для дрожжей - в 40 и 100 раз, для бактерий – в 100 раз.

Осветительная часть предназначена для освещения исследуемого объекта. Она состоит из источника света, встроенного в основание штатива, и конденсора, предназначенного для более полного освещения микроскопического объекта.

Механическая часть состоит из основания и штатива микроскопа, револьверного устройства, предметного столика, фокусировочных механизмов. Грубое перемещение осуществляется рукояткой механизма грубой фокусировки (макровинт), расположенной с левой стороны штатива, точное перемещение – рукоятками механизма микрометрической фокусировки (микровинт), расположенными с обеих сторон штатива. С помощью макровинта находится изображение, а с помощью микровинтов регулируется резкость и четкость изображения.

Исследуемые препараты помещают на предметный столик, закрепляя их между держателем и прижимом препаратоводителя, для этого прижим отводиться в сторону. Предметный столик перемещается рукоятками, расположенными с левой стороны, в продольном и поперечном направлении.

Четырехгнездное револьверное устройство обеспечивает установку объективов в рабочее положение. Смена объективов производиться вращением рифленого кольца револьверного устройства до фиксированного положения.

Правила работы с микроскопом.

1. Включить источник света.

2. Проверить положение конденсора.

3. Установить объектив увеличением в 4 раза в нужное положение.

4. Поднять предметный столик примерно на 1 см от объектива и, поворачивая рукоятку регулирования яркости источника света, найти оптимальную освещенность поля зрения.

5. С помощью револьверного устройства выставить нужный для работы объектив.

6. Поместить препарат на столик и, подняв рассматриваемый объект к нужному объективу как можно ближе, медленно опуская предметный столик с помощью макровинта, найти изображение, отрегулировать четкость изображения с помощью микровинта.

7. Окончив просмотр препарата, сначала опускают предметный столик, а затем препарат снимают со столика. Объективы протирают чистой тряпочкой или фильтровальной бумагой. Помыть и вытереть насухо все предметные и покровные стёкла.

Помимо микроскопа в микробиологической лаборатории используются следующие приборы:

Термостат — для поддержания температуры на нужном уровне при выращивании микроорганизмов.

Контейнер для анаэробного инкубирования - культивирование анаэробных микроорганизмов без доступа воздуха

Автоклав — применяется для стерилизации посуды, воды и питательных сред, для убивки выращенных микроорганизмов

Сушильный шкаф – для сухожаровой стерилизации посуды и инструментов.

Шкаф ламинарный - обеспечение стерильности исследовательских работ при проведении манипуляций в нем.

Счетчик колоний - подсчет колоний микроорганизмов.

Практическая часть работы.

Изучив устройство микроскопа, нужно научиться с ним работать и освоить методику приготовления микроскопических препаратов. Все рассмотренные препараты нужно зарисовать.

Под морфологическими признаками понимают строения клетки, размеры, форму клетки микроорганизмов, спорообразование, подвижность.

В условиях лаборатории можно определить морфологию картофельной и сенной палочки, молочно-кислых бактерий, гнилостных бактерий. Для этого необходимо вырастить различного вида бактерии. Для определения сенной палочки делают настой сена и готовят препарат, рассматривают под микроскопом. Молочно-кислые бактерии можно увидеть в капустном, огуречном и других рассолах/

1. Препарат живых клеток "раздавленная капля".

Если организмы находятся в жидкой среде на обезжиренное предметное стекло поместить каплю живых клеток бактерий и притереть покровным стеклом, для чего покровное стекло ставят сначала на предметное одним ребром, а затем плавно опускают, прижимая «раздавливая» при этом каплю.

Если культура выращена на твердой питательной среде, то на стекло предварительно наносят каплю воды, а затем помещают в неё клетки микроорганизмов бактериологической петлёй, прокалённой в пламени горелки, и тщательно размешивают. Не следует вносить много исследуемого материала, капля должна быть лишь слегка мутной. Материал, оставшийся на петле, сразу же сжигают в пламени горелки.

На поверхность покровного стекла наносят каплю иммерсионного масла и, погрузив в него объектив с увеличением в 100 раз, находят изображение.