Методы выявления возбудителя

Метод культивирования

Традиционно «золотым стандартом» в выявлении возбудителя считается культуральный метод диагностики. Заключается он в за-

43

---------------------------------------    Глава 3   --------------------------------------------

ражении культуры клеток L-929, Mc Coy или эпителиальных кле­ток оболочек желточных мешков 6-8-дневных куриных эмбрионов и выделении возбудителя с использованием моноклональных анти­тел. Преимуществом метода является высокая специфичность и чувствительность. Метод не дает ложноположительных результа­тов. К недостаткам относят его трудоемкость и дороговизну, что ограничивает его применение в повседневной практике. Как пра­вило, этот метод используется в научных целях.

Цитологический метод

Основан на микроскопическом исследовании мазка после окра­ски красителями. Чувствительность данного метода составляет 10-40%.

Это наиболее доступный и технически простой метод. Но его ди­агностическая ценность снижается из-за субъективной оценки ре­зультата.

Посев на специфическую среду

С целью выявления возбудителей можно использовать различ­ные посевы на специальные среды. Таким способом выделяют бактерии, грибы, микоплазму, уреаплазму. Метод позволяет опре­делить концентрацию микроорганизма в полученной среде, что во многих случаях является очень важным. Диагностически значи­мое количество микроорганизмов, выявляемых этой методикой, соответствует 10⁴ КОЕ /мл и более.

Молекулярно-биологические методы

Не так давно были разработаны молекулярно-биологические методы, основанные на анализе нуклеотидной последовательнос­ти, которые способны повысить титры чувствительности до 1:10 микроорганизмов. К ним относятся: метод ДНК-зондов, лигазная цепная реакция, полимеразная цепная реакция.

Метод ДНК-зондов. Метод точечной гибридизации нуклеино­вых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, мечен­ного биотином. Тесты, основанные на этой методике, имеют множество преимуществ с точки зрения транспортировки, обработ­ки и скорости исследования. Чувствительность метода — 78-90%, специфичность — 98%. Материалом для исследования является любая биологическая среда организма.

44

______________________    Глава 3   ------------------------------------------

Лигазная цепная реакция. Основана на зависимой от мишени амплификации с использованием термостабильной ДНК-лигазы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР была открыта в 1986 году американским биохимиком Кэри Мюллисом. ПЦР поз­воляет выявить в исследуемом материале наличие специфического участка ДНК, характерного для исследуемого организма, и много­кратно размножить его. В основе метода лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так назы­ваемая направленная амплификация ДНК). Специфичность мето­да составляет 100%, преимуществом является также быстрота получения результатов.

Серологические реакции

Принцип этих реакций основан на выявлении антигенов с помощью специфических антител — либо поликлональных, по­лученных при иммунизации животных антигенами, либо моно-клональных, полученных с помощью гибридомной технологии. В основе этих методов лежит реакция специфического связывания антиген-антитело. Различия методов заключаются в способах ре­гистрации и учета этой реакции. К основным серологическим ре­акциям относятся:

— реакция связывания комплемента (РСК);

— реакция нейтрализации (РН);

— реакция непрямой геммаглютинации (РНГА);.

— реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

— радиоиммунный анализ (РИА);

— иммуноферментный анализ (ELISA, ИФА).

В настоящее время классические серологические реакции типа РСК, РН, РПГА в силу их низкой чувствительности, высокой тру­доемкости, малой пригодности к автоматизации отступили на вто­рой план. Все большее распространение получили РИФ и ИФА.

Метод иммунофлюоресценции. Как в прямой, так и в непрямой модификации позволяет выявить возбудителя по содержанию в них антигена с помощью моноклональных антител. Метод быст­рый, простой и недорогой, но оценка результата является субъек­тивной и требует высокого уровня подготовки. Недостаточная чувствительность отмечена у больных с вялотекущей и асимптома-тической инфекцией.

Иммуноферментный метод. Полученный материал обрабаты­вается специальной тест-системой. Метод основан на определении антигена с помощью моноклональных антител.

45

---------------------------------------    Глава 3   -------------------------------------------

На положительный результат в этих случаях указывает измене­ние окраски пробы, которое измеряется спектрофотометрпческим способом. Данный метод позволяет одновременно проводить иссле­дование большого количества проб и объективно оценивать резуль­таты.

Однако в течение 1-1,5 месяца после излечения происходит слущивание разрушенных клеток, содержащих поверхностный антиген, с которым реагируют моноклональные антитела. Поэто­му в течение этого времени контрольный анализ может быть поло­жительным.

Выделение вирусов

Количество вируса в организме обычно бывает максимальным в первые несколько дней после заражения. К моменту появления первых симптомов у больного нередко бывает уже слишком поздно выделять вирус, вызвавший заражение. У некоторых людей, одна­ко, может наблюдаться длительное выделение вируса. Поэтому це­лесообразно пытаться выделять его у больных с подозрением на вирусную этиологию заболевания. Однако если вирус не найден, то это не исключает вероятности вирусной инфекции.

Выделение вируса у новорожденных с подозрением на врожден­ную инфекцию следует проводить как можно быстрее после рожде­ния, чтобы не спутать случаи с неонатальной инфекцией или инфекцией более позднего детского возраста.

Для правильной диагностики инфекционного процесса очень важно производить правильный забор материала. При подозрении на вирусную инфекцию пораженные органы не всегда являются те­ми участками организма, в которых легче всего выделить вирус. Мазки из носа и мокрота обычно непригодны для выделения виру­са. Моча также в ограниченной степени пригодна для этих целей, однако она является предпочительной пробой при исследовании на цитомегаловирусную инфекцию (ЦМВ). При вирусных заболева­ниях, вызывающих образование везикулярной сыпи, для выделе­ния вируса необходимо брать мазок содержимого везикул.

Выделение бактерий

Для того, чтобы максимально увеличить вероятность выделе­ния бактерий, необходимо отбирать материал для исследования до начала антибиотикотерапии. Материалом для бактериологическо­го исследования являются глоточные мазки, мазки из половых ор-

46

---------------------------------    Глава 3   ---------------------------------------------

ганов, гемокультура. Необходимо отметить, что при заборе матери­ала нужно учитывать, что некоторые возбудители являются внут­риклеточными паразитами (Chlamydia). Поэтому важно, чтобы были отобраны клетки, наиболее вероятно содержащие данные микроорганизмы.