Липосомный метод трансфекции

Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от деградации лизосомальными ферментами достигаются при использовании в качестве векторов липидных везикул (липосом), обладающих выраженными фузогенными свойствами. Особенно перспективны в этом отношении липосомы, полученные на основе катионных липидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности таких везикул обеспечивает их эффективное слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы. Особенно эффективными являются комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы) или с белками-лигандами. Эти конструкции обеспечивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клетки-мишени.

Рекомбинантные вирусы

Эволюционно сложившаяся система эффективного проникновения вирусов в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и система интеграции в клеточный геном позволяет использовать вирусы, как естественные векторы чужеродной ДНК для клеток млекопитающих.

В качестве векторов чаще всего применяют следующие рекомбинантные вирусы:

1) ретровирусы

2) аденовирусы

3) аденоассоциированные вирусы

4) вирус гепреса (HSV)

5) вирус ВИЧ (HIV)

6) вирус ветряной оспы

Ретровирусные векторы представляют собой генные конструкции на основе ретровирусов (РНК-содержащих вирусов), особенно часто используемые для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярным ретровирусным вектором является вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV). По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. Для безопасности ретровирусные последовательности модифицируют таким образом, что в инфицированных ими клетках не производятся вирусные белки. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих последовательностей вируса. Репликация вирусных векторов может происходить только в специальных "пакующих" клетках, в геном которых встроены все гены, кодирующие вирусные белки. При введении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирионы, несущие векторные РНК и способные лишь проникать в клетки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком данной системы, также как и других векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации производящей клеточной линии нормальным ретровирусом и получения на его основе компетентного по репликации вируса. Для предотвращения этого необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток. К другим серьезным недостаткам ретровирусных векторов относятся:

1) их способность трансдуцировать только пролиферирующие клетки;

2) способность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;

3) возможность спонтанной активации онкогена;

4) небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8000 п.о.

5) сравнительно низкий титр (10⁶ - 10⁷ на 1 мл) рекомбинантных вирусных частиц, получаемых для трансдукции;

6) необходимость конструирования соответствующих "пакующих" клонов клеток;

Аденовирусные векторы в отличие от ретровирусов активно инфицируют неделящиеся клетки, обладают большей потенциальной пакующей способностью (>8000 п.о.), имеют более высокий титр (10¹¹ на 1 мл), однако не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном клетки-хозяина. Их использование перспективно для генокоррекции клеток верхних дыхательных путей, легких, мозга, печени, мышц, кожи и др. Данный тип векторов был использован в первых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза, показавших их эффективность при доставке аэрозольным способом. В аденовирусные векторы также инсерцируют маркерные гены (neo, CAT, β-галактозидазный ген (β-Gal)) для последующей идентификации трансдуцированных клеток. Для конструирования векторов используют дефектные по репликации аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов, кодирующих белки E1a, E1b, а также регуляторный белок E4. Такая конструкция может поддерживаться только в присутствии клеток-помошников (например, в культуре клеток почек человека). Удаление большого числа аденовирусных генов из векторов часто сопровождается их дестабилизацией, что является одним из главных их недостатков, так как в ряде случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мишени способствуют формированию иммунного ответа.

Аденоассоциированные вирусы (AAV) обладают значительно меньшей пакующей способностью (~5000 п.о.). Однако, в отличие от ранее рассмотренных вирусов, они не обладают онкогенной активностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где преобладают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV является их способность к стабильной неслучайной интеграции в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции вируса определяется наличием в его геноме гена rep. близкородственные к AAV парвовирусы (H1, MVM, LuIII) обладают еще меньшей пакующей способностью (~2000 п.о.) и не обладают способностью к специфическому встраиванию. Однако, они также рассматриваются как потенциальные векторы.

Вирус простого герпеса (HSV) - это крупный (152 тыс. п.о.) ДНК-содержащий вирус, не интегрирующийся в геном при трансформации и формирующий эписомные структуры в ядрах клеток. Уникальной особенностью HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной ткани, в связи с чем представляется перспективным его использование для терапии опухолей ЦНС, а также болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваний. Преимуществом HSV как вектора для генной терапии состоит в его высокой пакующей способности (> 30 000 п.о.). Важным этапом в создании векторов на основе HSV является удаление из его генома области ICP22, ответственной за синтез литических белков, и индукция мутации 1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее время на основе HSV стали получать искусственные производные вируса, так называемые "ампликон-продукты", лишенные практически всех генов HSV, но способные к репликации.

Конструкции векторов, используемых для переноса экзогенных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов, сконструированных на основе псевдоаденовирусов, сочетает в себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом собственные вирусные гены практически не оказывают никакого повреждающего эффекта на трансформированные клетки-мишени, так как содержат очень мало регуляторных элементов и последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию аденовируса. Кроме того, псевдоаденовирусные векторы с успехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в делящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспективы использования для генной терапии других вирусных систем, таких как SV40, HIV (ВИЧ), вирус ветряной оспы и др. В частности, представляются перспективными эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векторы, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейна-Барра, который способен нести вставку размером от 60 до 330 тыс. п.о.

В последнее время, особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes, MAC), которые могли бы достаточно автономно находиться в ядре, сохраняя способность к репликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представляются циркулярные микрохромосомы раковых клеток.

Особенно привлекательной в отношении генной коррекции представляется возможность замены всего мутантного гена или его мутировавшей части (например, одного экзона) на его нормальный аналог, что может быть достигнуто с помощью гомологической рекомбинации. Такой подход может обеспечить не только продолжительную персистенцию введенного гена, но и сохранение удовлетворительного уровня его экспрессии. С этой целью, в конструкции, используемые для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомологичного спаривания, например, ген бактериальной рекомбиназы. В таких условиях частота гомологичной рекомбинации может быть достаточной для того, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток.

Тема: "Использование ДНК-технологий в медицине: методы ПЦР и секвенирования. генная терапия "

Часть I

1. С помощью классической ПЦР возможно:

1. Осуществлять полуколичественный анализ экспрессии генов

2. Проводить STR-анализ

3. Проводить одновременную амплификацию большого количества различных фрагментов ДНК

4. Позволяет осуществлять наработку фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования (клонирования или секвенирования).

5. Осуществлять сиквенс ДНК

2. Праймеры для ПЦР представляют собой:

1. Короткие искусственно синтезированные РНК-олигонуклеотиды

2. Короткие ДНК-олигонуклеотиды, выделяемые из клеток

3. Короткие искусственно синтезированные ДНК-олигонуклеотиды

4. Короткие РНК-олигонуклеотиды, выделяемые из клеток

5. Короткие ДНК-олигонуклеотиды, комплементарные участкам, фланкирующим амплифицируемую последовательность

3. Температура плавления двухцепочечной ДНК зависит от:

1. Соотношением GC/AT пар

2. Происхождения ДНК

3. Соотношения АТ/GC пар

4. Вторичной структуры ДНК

5. Третичной структуры ДНК

4. Необходимыми компонентами реакционной смеси ПЦР являются:

1. Эндонуклеаза

2. Mg²⁺

3. Ca²⁺

4. dNTP 4-х типов

5. dNDP 4-х типов

5. Дли проведения ПЦР можно использовать ферменты:

1. Экзонуклеаза

2. Эукариотическая ДНК-зависимая ДНК-полимераза

3. Taq -полимераза

4. Рестриктаза EcoRI

5. Tth -полимераза

6. В результате 30 циклов ПЦР будет получено следующее число копий амплифицируемого участка ДНК:

1. 1 274 741 324

2. 1 073 741 824

3. 1 172 741 824

4. 1 073 741 822

5. 1 073 742 824

7. Выберите утверждения, правильно характеризующие свойства Taq -полимеразы:

1. эффективно амплифицирует фрагменты длиной 30 00-50 00 п. н.

2. эффективно амплифицирует фрагменты длиной 3000-5000 п. н.

3. обладает хорошо выраженной 5ʹ-3ʹ-экзонуклеазной активностью, но не проявляет корректирующей 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазной активности

4. обладает слабо выраженной 5ʹ-3ʹ-экзонуклеазной активностью, но проявляет выраженную корректирующую 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазную активность

5. не проявляет ни 5ʹ-3ʹ- ни 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазной активности

8. Выберите утверждения, правильно характеризующие STR -локусы:

1. Число повторов в каждом STR высоковариабильно в популяции, с разбросом от 4 до 40 у разных индивидов

2. два неродственных человека, как правило, несут одинаковые пары последовательностей

3. два неродственных человека, как правило, несут разные пары последовательностей

4. Число повторов в каждом STR высоковариабильно в геноме одного человека, с разбросом от 4 до 40 у одного индивида

5. Длина STR-локусов не может совпадать у двух разных индивидов