Определение эффективности амплификации

Из уравнения (3) видно, что эффективность реакции можно рассчитать как E=10^-1/k, где k берется из уравнения прямой C_t = k·log P₀ + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E=2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32.

Значения k < -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции. Желательно добиваться таких условий реакции, в которых эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (k не больше -4 — -4.2).

С другой стороны, иногда k оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации E > 2. Небольшое превышение (-3.32 < k < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений.

Обработка данных ПЦР в реальном времени

Методы обработки данных ПЦР в реальном времени основаны на применении уравнения (3). Существует два основных метода обработки данных ПЦР в реальном времени:

- Метод калибровочного графика.

- Прямое сравнение данных.

1.3.3.1 Метод калибровочного графика

Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C_t - log P₀ с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P₀) в экспериментальных образцах.

1.3.3.2 Прямое сравнение данных

Из уравнения (3) следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата (R) будет равна:

Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, гену домашнего хозяйства). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью E_ref. Тогда:

(4)

Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, то можно записать:

 (5)

Если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, уравнение упрощается до вида:

 (6)

При проведении ОТ-ПЦР (RT-PCR) в реальном времени в качестве REF можно использовать последовательность генов домашнего хозяйства, однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии генов домашнего хозяйства порой довольно значительно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации нескольких генов домашнего хозяйства.

Мостиковая ПЦР

В случаях, когда поставленные задачи требуют проведения высокоэффективного секвенирования, 1536-ти луночного планшета (или даже сотни таких планшетов) для ПЦР оказывается недостаточно. В таких случаях требуются миллионы отдельных реакций, в каждой из которых будет получен гомогенный продукт ПЦР.

Одним из методов, позволяющих решить данную задачу, является мостиковая ПЦР (bridge PCR). Принцип данного метода заключается в проведении ПЦР с праймерами, прикрепленными к твердой подложке, наподобие предметного стекла. С пришитого к поверхности праймера синтезируется фрагмент ДНК. После этапа денатурации, фрагмент снова взаимодействует с праймером на поверхности, образую дугу (мостик) между двумя точками на подложке (Рис. 15).

Рис. 15 Принцип действия мостиковой ПЦР

При повторных циклах ПЦР, из точки синтеза первого фрагмента колония фрагментов ДНК будет быстро расти.

Технология мостиковой ПЦР используется для создания клональных библиотек фрагментов ДНК в приборах компании Illumina.