ПЦР в реальном времени ( Real - Time - PCR , qPCR , qRT - PCR )

Поскольку в ходе ПЦР происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный фрагмент при помощи ряда методов, наиболее популярным из которых является метод электрофореза в геле с окрашиванием ДНК бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает информации об эффективности процесса. Поэтому применение классической ПЦР ограничено задачами, в которых достаточно получения ответа по принципу "да - нет".

В начале 1990-х гг. было предложено регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР с целью количественного определения исходного числа ДНК-матриц, попавших в реакционную смесь. Для регистрации процесса амплификации в режиме реального времени в реакционную смесь добавляют флуоресцирующие и/или интеркалирующие красители, такие как SYBRGreen, SYBRBlue или ROX, по интенсивности флуоресценции которых можно судить об эффективности процесса амплификации (Рис. 8). Использование оптической детекции также исключает необходимость стадии электрофореза. Кроме того, флуоресцентные методы позволяют избирательно регистрировать амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК, что повышает достоверность исследования.

Рис. 8.Детекция кинетики ПЦР в реальном времени с помощью флуоресцентных зондов.

Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением:

 (1)

где P_n - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P₀ - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.к. на каждом цикле ПЦР происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмировав обе части уравнения (1) получим:

 (2)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C_t)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция P_Ct = const. Для n=C_t уравнение 2 принимает вид:

 (3)

Т.е. значение С_t прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, ПЦР в реальном времени позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Однако величина С_t может зависеть от многих случайных факторов, например чувствительности детектора, качество фильтра. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормализацию обычно проводят по продуктам амплификации так называемых генов домашнего хозяйства (housekeeping genes) уровень экспрессии которых в клетке всегда примерно одинаков.

Вместе с тем, классическая ПЦР сохраняет свою актуальность в методиках, требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования (клонирования или секвенирования). В этих случаях, присутствие интеркалирующих красителей может помешать последующим процедурам.