Типы генотерапевтических вмешательств и выбор клеток-мишеней

Генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мишени. Она проводится либо с целью коррекции наследственной патологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. В первом случае в организм пациента вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. Второй подход применяют для лечения онкологических и инфекционных заболеваний. В этих случаях вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способствующие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для таких генов могут служить пораженные ткани, иммунные клетки, специфическим образом проникающие в эти ткани, либо предварительно трансформированные in vitro другие клетки. В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная терапия (ex vivo) предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту. В настоящее время, большинство допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используют подход ex vivo. Генная терапия ex vivo включает следующие этапы (Рис. 34):

1) получение клеток от больного;

2) исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки;

3) отбор и наращивание генетически "исправленных" клеток;

4) инфузия или трансплантация этих клеток пациенту;

Рис 34. Принцип генной терапии ex vivo

Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется иммунный ответ.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного (Рис. 35). При этом вводимые ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени. В настоящее время этот подход опробирован только для лечения муковисцидоза.

Рис. 35 Принцип генной терапии in vivo

Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, эмфизема, рак легких, при которых объектами генетической модификации являются специфические типы легочных клеток. Инъецируемые вакцины могут использоваться для модификации различных типов клеток и представляют собой наиболее универсальный способ доставки чужеродного генетического материала в любые ткани.

Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. План генотерапевтических вмешательств определяется также доступностью клеток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в организме, эффективностью и специфичностью трансфекции клеток и продолжительностью экспрессии введенного гена.

Наиболее перспективной представляется возможность генетической модификации не самих дифференцированных клеток с наследственным дефектом, а их предшественников - плюрипотентных стволовых клеток.

Определение типа клеток, подлежащих генетической модификации, завершается оценкой результата переноса гена в системе in vitro и проведением экспериментов на животных моделях. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых культурах, полученных после предварительной трансформации первичных культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его коррекции на биохимическом уровне.

Тем не менее, многие проблемы генной терапии не могут быть решены на клеточном уровне. Важное значение имеет анализ влияния введенных ДНК на межклеточные взаимодействия, определяющие работу соответствующих тканей и органов. Такие исследования могут быть проведены только in vivo.