Физико-химические методы переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот

Чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот благодаря наличию в плазматической мембране белков, специфически связывающих ДНК. Путем эндоцитоза чужеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом и обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из экзосом, попадает в ядро и если не разрушается эндогенными нуклеазами, то может быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случается достаточно редко. Исключение составляют скелетные мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК может долго (до 1 года) сохраняться и даже экспрессироваться.

Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени может быть осуществлена путем микроиньекции, при помощи электропорации, а также посредством перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами, коньюгированными с чужеродными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбардировки). Эти методы доставки применимы главным образом для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод бомбардировки с использованием специального "генного ружья", который успешно применяется in vivo.

Для повышения эффективности переноса обычно используют соединения или группы соединений, взаимодействующие с ДНК с образованием компактных структур, облегчающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от действия нуклеаз. Примерами таких способов трансфекции являются система кальций-фосфорной коприципитации, а также рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий создание трехкомпонентной конструкции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус.

В качестве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалогликопротеин, коньюгированный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействующие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию генной конструкции на специфических клетках (Рис. 36).

Рис. 36 Рецептор-опосредованный перенос гена

Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизин, ДЭАЭ-декстран). Важным компонентом системы является аденовирус, выступающий в качестве эффективного фузогенного агента, обеспечивающего выход экзогенной ДНК из эндосом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адресная доставка и защита от действия лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конструкций.

Еще одной системой, основанной на сочетании физико-химического подхода и использования вирусов, является конструкция, основанная на использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фага, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсертируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полилизиновые мотивы в составе химерного белка связываются с плазмидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательность ДНК, кодирующую какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий конструкцию внутрь клетки. Для этой цели могут использоваться гены патогенных бактерий, поражающих кишечный эпителий, кодирующих белки интерналин и инвазин, а также последовательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабельных доменов моноклональных антител.

Направленный перенос генов во многие типы клеток, содержащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существенно облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание ее в ядро.