Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Специфические системы детекции
Поскольку даже хорошо подобранная пара праймеров может давать нежелательные продукты амплификации (например, димеры праймеров) использование методик с регистрацией накопления только "нужных" фрагментов ДНК является более надежным экспериментальным подходом. Все специфические системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси меченного олигонуклеотида (одного или нескольких), неспособного выступать в качестве затравки и комплементарного уникальной части амплифицируемой последовательности. Меченный олигонуклеотид может быть прикреплен к праймеру или находиться в растворе в свободной форме. К специфическим системам детекции относятся праймеры-пробы ("скорпионы"), линейные разрушаемые пробы (TaqMan), пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons), а также системы меток, работающих на основе метода FRET. 1.3.1.2.1 Праймеры-пробы ("скорпионы") В основе данного методы лежит идея объединения праймера и гибридизационной пробы в одну молекулу. Для этого к 5ʹ-концу праймера прикрепляется адаптер со структурой типа "стебель-петля", в котором петлевая часть адаптерной шпильки комплементарна внутренней части образующегося фрагмента (Рис. 11). Эта структура практически полностью повторяет праймеры типа "амплифлюр" с той лишь разницей, что адаптер отделен от праймера блокатором синтеза второй цепи ДНК во избежание его удвоения. Рис. 11 Схема работы праймеров-скорпионов Таким образом, после образования продукта реакции, петлевая часть адаптерной последовательности может гибридизоваться на внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя флуоресценции и, как следствие, у усилению сигнала. 1.3.1.2.2 Линейные разрушаемые пробы (TaqMan) В данном подходе, олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР, метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизуется на ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5ʹ-экзонуклеазной активности Taq -полимеразы (Рис. 12). Рис. 12 Схема действия механизма TaqMan При этом интенсивность сигнала нарастает пропорционально увеличению количества ампликонов. В данном подходе, принципиальным моментом является использование ДНК-полимераз с хорошо выраженной 5ʹ-экзонуклеазной активностью.
1.3.1.2.3 Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons) В данной методике флуорофор и гаситель располагают на противоположных концах олигонуклеотида. Зонды, находящиеся в растворе при температуре ниже 55-60°С образуют структуру типа "стебель-петля" с очень низким уровнем флуоресценции. При гибридизации с ампликоном зонд разворачивается, что ведет к увеличению уровня флуоресценции (Рис. 13). Рис. 13 Схема работы молекулярных "маячков" 1.3.1.2.4 Метки, работающие на основе метода флуоресцентного резонансного переноса энергии (fluorescent resonance energy transfer, FRET). В данной методике используются 2 олигонуклеотидных зонда, каждый из которых помечен своим флуорофором, один из которых имеет максимум поглощения в более коротковолновой, а другой в более длинноволновой части спектра. Метки подбираются таким образом, чтобы максимум эмиссии флуорофора с более коротковолновым максимумом поглощения был близок к максимуму поглощения второго флуорофора. Таким образом, один зонд несет флуорофор-донор, а другой - флуорофор-акцептор флуоресценции. Последовательность зондов задается таким образом, чтобы они могли гибридизоваться с матричной ДНК в непосредственной близости друг от друга. Гибридизация двух зондов с матрицей ведет к сближению флуорофоров и к туннельному переносу энергии с донора на акцептор (Рис. 14). Детекцию продуктов амплификации ведут посредством регистрации флуоресценции флуорофора-акцептора при длине волны возбуждения флуорофора-донора. Данный подход наиболее широко используется при анализе однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNPs). Рис. 14 Детекция продуктов ПЦР методом FRET
|
|||||
Последнее изменение этой страницы: 2020-10-24; просмотров: 374; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.216.190.182 (0.008 с.) |