Количественное определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по методу Иендрашика, Клеггорна и Гроффа

Задание 1.Определить содержание общего, связанного и свободного билирубина в сыворотке крови методом Иендрашика, Клеггорна и Гроффа.

Принцип. Метод базируется на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина образовывать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розово-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разности между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного.

Ход работы. В три пробирки вносят, в соответствии с таблицей, необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

Реактивы	Общий билирубин, мл	Связанный билирубин, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0,5	0,5	0,5
Кофеиновый реактив	1,75	-	1,75
Раствор натрия хлорида	-	1,75	0,25
Диазореактив	0,25	0,25	-

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного - на 5-10 мин (при более продолжительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин). По окончании указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭК при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина отнимают экстикцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику. Свободный билирубин рассчитывают по разности между количеством общего и связанного. Рассчитывают содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и делают вывод о причинах возможных отклонений этих показателей.

Клинико-диагностическое значение. В норме содержание общего билирубина в сыворотке крови составляет 4,0-21,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю свободного билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% на долю связанного (2,0-5,0 мкмоль/л). К основным факторам, которые вызывают нарушение обмена жёлчных пигментов, принадлежат: повышенный гемолиз эритроцитов, нарушение синтеза билирубинглюкуронидов, нарушение выделения связанного билирубина из гепатоцитов в жёлчные капилляры (деструкция гепатоцитов), нарушение жёлчевыделения вследствие обтурации внепечёночных жёлчевыводящих путей. Паренхиматозная желтуха возникает при гепатитах, циррозах печени и характеризуется резким повышением содержания связанного билирубина в крови. В печени снижается образование билирубинглюкуронида, вследствие этого содержание свободного билирубина в крови также увеличивается. Гемолитическая желтуха возникает при усиленном гемолизе эритроцитов, что приводит к усилению образования свободного билирубина, так как печень не успевает его связывать. Увеличение концентрации связанного билирубина в случае обтурационной желтухи обусловлено перенаполнением жёлчных путей вследствие закупорки, разрыва и в дальнейшем переходе компонентов жёлчи в кровь; при этом в крови накапливается связанный билирубин (гипербилирубинемия), из мочи исчезает уробилиноген, однако вследствие билирубинурии она приобретает тёмную окраску, а из кала исчезает стеркобилин. В клинико-биохимических лабораториях проводят определение содержания билирубина и его фракций для дифференциальной диагностики желтух.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 462-467.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 577-584.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 562-566.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 506-508, 561-565.

5. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 645-655.

6. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 209-212.

ЗАНЯТИЕ 7

Тема: Биохимия почек и мочи. Физико-химические свойства и химический состав мочи в норме. Биохимическое исследование мочи.

Актуальность. Почки - один из важнейших органов, основное назначение которого заключается в поддержании динамического постоянства внутренней среды организма. Почки принимают участие в регуляции водно-электролитного баланса, кровяного давления, поддержке кислотно-щелоч-ного состояния, осмотического давления жидкостей организма; стимуляции эритропоэза и др. Почки вырабатывают мочу из компонентов плазмы крови. С мочой выделяется до 150 разных веществ. В суточной моче содержится в среднем около 40 г органических веществ и приблизительно 20 г неорганических. Биохимическое исследование мочи играет важную роль в клинике для диагностики и прогноза заболевания, контроля эффективности лечения.

Цель. Ознакомиться с основными физико-химическими свойствами мочи (диурез, рН, плотность, цвет, прозрачность, запах) и химическим составом нормальной мочи. Ознакомиться с методами клинического и биохимического анализа мочи. Запомнить некоторые физико-химические константы и биохимические показатели мочи в норме с целью использования их для диагностики заболеваний, правильной оценки отклонений от нормы.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Функции почек и особенности обмена веществ в них.

2. Биохимические механизмы регуляции функции почек.

3. Общие свойства и химический состав нормальной мочи. Значение исследования в клинике.

4. Органическое и неорганическое вещества нормальной мочи. Их изменения в зависимости от возраста.

5. Физико-химические показатели мочи: диурез, относительная плотность, рН, запах, цвет, прозрачность. Значение их исследования. Возможные отклонения от нормы.

6. Клинико-диагностическое значение количественного и качественного анализа мочи.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. У спортсмена, который находился на диете с большим количеством белков, установлена кислая реакция мочи. Наличие каких веществ приводит к таким изменениям?

А.Хлориды и фосфаты. С.Фосфаты и сульфаты. В. Хлориды и сульфаты. D. Ураты и сульфаты.

Е. Ураты и хлориды.

2. Прозрачность мочи является одним из параметров, которые оцениваются при её анализе. С наличием каких веществ может быть связано помутнение мочи, имеющей щелочную реакцию?

А. Фосфата кальция. В. Сульфата магния.

С. Уратов. D. Хлоридов.

Е. Солей аммиака.

3. Почки выполняют все функции, кроме:

А. Выделяют конечные продукты обмена. В. Регулируют водно-солевой обмен. С. Поддерживают осмотическое давление.

D. Регулируют артериаль- ное давление крови. Е. Раскладывают мочевину на СО2 и Н2О.

4. Органоспецифическим ферментом почек является:

А. Лактатдегидрогеназа. В. Сукцинатдегидрогеназа. С. Аспартатаминотрансфераза.

D. Трансамидиназа. Е. Креатинфосфокиназа.

5. В результате фильтрации плазмы крови в первичную мочу переходят все вещества, кроме:

А. Моносахаридов (глюкозы и фруктозы). В. Мочевины и мочевой кислоты. С. Низкомолекулярных белков.

D. Креатина и креатинина. Е. Средне- и высокомоле- кулярных белков.

6. Поддержание постоянства рН в организме с помощью почек осуществляется в процессе реабсорбции ионов Na⁺ и секреции Н⁺. В основе их действия лежат все перечисленные химические процессы, за исключением:

A. Реабсорбция Na⁺ во время преобразования двузамещённых фосфатов
в однозамещённые.

B. Избирательное всасывание ионов Na⁺ в клетках канальцев взамен на
ионы Н⁺, идущих в просвет канальцев.

C. Диссоциация Н₂СО₃ на НСО₃^- и Н⁺, последний выводится из организма. D.Задержке ионов Na⁺ способствуют реакции образования аммиака и
использование его для нейтрализации кислых метаболитов.

E. Выведение мочевины с мочой.

7. Для диагностики заболевания мутную мочу с щелочной реакцией подкислили и подогрели. При этом осадок исчез. Чем обусловлена мутность мочи?

А. Слизь из мочевыводящих путей. В. Микрофлора, которая раскладывает мочевину с образованием аммиака. С. Гной из уретры.

D. Белок почечного проис- хождения. Е. Фосфаты кальция и маг- ния, ураты.

8. Какой из физико-химических показателей мочи зависит от диуреза?

А. Цвет. В. рН. С. Относительная плотность.

D. Запах. Е. Прозрачность.

9. Какие из приведенных показателей рН и относительной плотности мочи взрослого человека отвечают норме?

А. рН=4,8; плотность 1,001. В. рН=8,0; плотность 1,040. С. рН=8,5; плотность 1,029.

D. рН=3,5; плотность 1,020. Е. рН=6,0; плотность 1,021.

10. Как можно определить патологическое состояние взрослого человека, у которого наблюдается прекращение выделения мочи?

А. Энурез. В. Олигурия. С. Анурия. D. Никтурия. Е. Дизурия.

11. Как можно определить патологическое состояние взрослого человека, у которого суточный диурез составляет 500 мл?

А. Анурия. В. Полиурия. С. Никтурия. D. Олигурия. Е. Поллакиурия.

12. Содержание аммиака в моче является важным показателем кислотно-щелочного состояния организма; количество аммиака повышается как при респираторном, так и метаболическом ацидозе. Это связано со стимуляцией при ацидозе синтеза в клетках эпителия почечных канальцев ферментов:

 

А. Глутаминазы. В. Цикла Кребса.

С. Карбоангидразы. D. АТФ-азы.

Е. Гиалуронидазы.

13. Больной, 45 лет, жалуется на неутолимую жажду, потребление большого количества жидкости (до 5 л), выделение значительного количества мочи (до 6 л в сутки). Концентрация глюкозы в крови составляет 4,4 ммоль/л, уровень кетоновых тел не повышен. Моча неокрашена, удельный вес 1,002; сахар в моче не определяется. Дефицит какого гормона может привести к таким изменениям?

A. Глюкагона. B. Альдостерона. C. Инсулина. D. Вазопрессина.

14. При лабораторном исследовании ребёнка выявлено повышенное содержание в моче лейцина, валина, изолейцина и их кетопроизводных. Моча имеет характерный запах кленового сиропа. Недостаточностью какого фермента вызваны данные изменения?

А. Дегидрогеназы α-кетокислот. В. Аминотрансферазы. С. Глюкозо-6-фосфатазы.

D. Фосфофруктокиназы. Е. Фосфофруктомутазы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА