Оптические методы идентификации комплексов антиген-антитело

Нефелометрия — определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации АГ, поскольку при добавлении к ним АТ образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, C3, C4, фактора B, C-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. Для нефелометри оптимальны растворы низкой концентрации (в отличие от турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концентрации, поскольку в этом случае измеряется потеря проходящего света).

Чувствительность метода - 100 мкг/мл при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании чистых растворов. Данным методом можно проводить до 120 анализов в час.

Аппаратура для нефелометрических исследований представляет собой специализированные спектрофотометры для измерения интенсивности рассеянного света под углом к направлению падающего на раствор светового потока. Длины волн, используемые в большинстве нефелометров, находятся в диапазоне 340—650 нм.

Первым способность частиц рассеивать свет описал Дж. Рэлей (J. Rayleigh) более 100 лет тому назад. Важная в прикладном плане суть этого явления заключается в том, что интенсивность и направление светового потока, рассеянного гомогенной взвесью частиц, зависят от размера частиц в соответствии с рисунком 4.1. Рэлеевское, или симметричное, рассеяние имеет место, когда размер частиц не превышает 0,1 от длины волны — вариант «А». Частицы больших размеров рассеивают свет неравномерно. Когда размер (d) приблизительно равен длине волны светового потока (X), вперед — по направлению потока рассеивается больше света, чем в обратном направлении — случай «Б» на рисунке 3.1.

Рисунок 3.1 Рассеяние света при различных соотношениях размера частиц d и длины волны электромагнитного излучения X

 

Схема анализатора - нефелометра представлена на рисунке 3.2.

 

Рисунок 3.2. Принципиальная схема нефелометра

1- источник световой энергии; 2-полосовой фильтр; 3-кювета; 4-фотоприемник; Ф_о -падающий поток световой энергии; Ф_р-поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Δλ-полоса пропускания светофильтра

Турбидиметрический метод анализа. Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Несмотря на то, что в отношении определения концентрации Ig метод нефелометрии более чувствителен, преимуществом турбидиметрического анализа является возможность проведения измерения практически на любом колориметре или фотометре. Направления прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения турбидиметрических исследований, показаны на рисунке 3.3. Основные компоненты, которые используются при построении нефелометрических и турбидиметрических приборов, похожи и включают источник света, фильтр и фокусирующую световой поток систему линз, кювету с образцом и детектор с устройствами отображения и регистрации результата. В качестве источника света обычно используются ртутные дуговые лампы, вольфрамо-йодистые лампы и гелий-неоновые лазеры. Лазеры излучают монохроматический свет, сконцентрированный в узкий и интенсивный луч.

Рисунок 3.3. Схема, иллюстрирующая направления светового потока

При турбидиметрии

1-источник световой энергии; 2-полосовой фильтр, в некоторых случаях фильтр отсутствует, и измерение проводится в «белом» свете; 3-кювета; 4-фотоприемник; Ф₀ -падающий поток световой энергии; Ф_р -поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Ф-поток световой энергии, прошедший раствор; Δλ — полоса пропускания светофильтра

 

Индикаторные методы

К группе индикаторных методов относятся иммунохимические методы определения концентрации Ig, использующие в качестве меченых агентов различные варианты маркерных веществ, позволяющих количественно регистрировать с высокой точностью образовавшиеся комплексы «АГ-АТ».

Радиоиммунный анализ (РИА). Этот высокочувствительный метод разработан более 40 лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого АГ с АТ.

Принцип метода заключается в следующем: 1) известное количество АТ смешивают с известным количеством меченого АГ и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество АГ); 2) АГ, содержащийся в пробе, и стандартный меченый АГ связываются с АТ, 3) чем выше содержание немеченого АГ, тем меньше меченого АГ свяжется с АТ.

Концентрацию АГ в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности ИК. Тот же подход может быть использован для определения концентрации АТ в пробе. В этом случае известное количество АГ смешивают с известным количеством стандартных меченых АТ и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество АТ). Другая модификация метода основана на иммобилизации АГ или АТ на твердой подложке.

Основные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В середине 60-х годов для идентификации и локализации АГ в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10-12 М и ниже). В настоящее время иммуноферментные методы анализа являются наиболее широко используемыми в лабораторной практике.

Основные принципы ИФА:· комплекс АГ-АТ можно выявить, если ввести в состав одного из участников иммунной реакции - ковалентно присоединить - одну или несколько молекул фермента. Причем процесс конъюгирования с ферментом ни на промежуточных (в процессе конъюгирования), ни на финальной стадии (конъюгат антигена или антитела с ферментом) не должен изменять иммунные свойства фермент-меченого участника иммунной реакции;· проявление ИК осуществляется с использованием способности фермента расщеплять субстрат, который при ферментативной модификации изменяет свой цвет. Способ детекции – спектрофотометрический;· ИК можно выявлять как в растворе, так и при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на твердом носителе.

Выделяют следующие виды ИФА: твердофазный (иммобилизированные антитела сорбированы на твердом носителе, например, полистерольном планшете), гомогенный (в гомогенном растворе), флуоресцентный (с использованием флуоресцентных меток). В зависимости от стадийности выполнения различают прямой, непрямой ИФА и ИФА с комплементом.

В иммунодиагностике ИФА нашел широкое применение для количественного анализа субклассов Ig. Иммуноферментный анализ, основе которого лежит применение антител, связанных с ферментом, в англоязычной литературе получил название ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).