Приготовление проявляющего реагента

В качестве проявляющего реагента используют коммерческий препарат конъюгата кроличьих АТ к суммарной фракции иммуноглобулинов IgG1 человека, меченых пероксидазой хрена, который разводится буфером Na-ФСБ в соотношении 1: 1000. Объем на одну пробу – 200 мкл разведенного конъюгата антиIgG-ПХ.

Приготовление хромогенной смеси

Субстратная смесь для конечной стадии анализа готовится непосредcтвенно перед употреблением по следующей методике: 8 мг ортофенилендиамина (ОФД) растворяют в 20 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, рН 5,0; к полученному раствору добавляют 8 мкл 30% раствора H₂O₂

Б. Выполнение анализа

Стадия: взаимодействие АТ с иммобилизванным на полистироле анти- IgG1 АТ

· Калибровочная кривая

В лунки полистирольного планшета с иммобилизованными анти- IgG1 антителами вносят по 200 мкл раствора каждого стандарта (от 0 до 500 нг) в повторах

 

· Анализируемые пробы

В лунки полистирольного планшета с иммобилизованными анти- IgG1 антителами вносят по 200 мкл анализируемой сыворотки крови, разведенной в 32 и 64 раза в повторах. Планшет инкубируют при комнатной температуре при слабом перемешивании на лабораторном шейкере в течение 60 минут, затем раствор удаляют и планшет трижды промывают дистиллированной водой для удаления несвязанных АТ.

2 стадия: проявление образовавшихся на твердой фазе иммунных комплексов с помощью конъюгата анти- IgG1 –ПХ

- в лунки планшета с калибровочными и анализируемыми пробами вносят по 200 мкл раствора анти- IgG1 –ПХ;

- планшет инкубируют при комнатной температуре и слабом перемешивании на лабораторном шейкере в течение 45 мин, затем раствор удаляют и планшет трижды промывают дистиллированной водой для удаления несвязанного конъюгата анти- IgG1 ПХ;

- в лунки планшета с калибровочными и анализируемыми пробами вносят по 150 мкл свежеприготовленного раствора хромогенной смеси;

- планшет инкубируют при комнатной температуре при слабом перемешивании на лабораторном шейкере в течение 15 минут для развития окраски (от бледно-лимонного до насыщенно-оранжевого цвета);

- реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл 10% раствора H₂SO₄ ;

- оптическую плотность в пробах измеряют с использованием ИФА-риддера с длиной волны 492 нм.

В. Построение калибровочной кривой и определение концентрации иммуноглобулина IgG1 в анализируемых пробах

Для построения калибровочной кривой используют среднее от результатов измерения в двух аналогичных пробах. Калибровочная кривая строится как зависимость полученных значений оптической плотности (B _OD492) от концентрации антител в пробе (от 0 до 500 нг) в соответствии с рисунком 4.13.

Определение концентрации АТ в анализируемых пробах проводится с использованием калибровочного графика.

Полученные значения концентрации АТ в пробе используются для расчета содержания IgG1 в миллилитре сыворотке крови по следующей формуле:

 

C = 5^. n ^. c, (3.1)

где n – разведение образца сыворотки, c – концентрация АТ в анализируемой пробе разведенной.

Содержание отчета

Зарисуйте необходимые схемы и графики.

Приведите расчетные данные по определенным количественным параметрам результатов ИФА.

Проанализируйте диагностическое значение полученных результатов.

Контрольные вопросы

1 Структура молекулы АТ. Функции отдельных участков молекулы Ig

2. Нормативные показатели концентрации Ig разных классов сыворотки крови человека

3. Физиологическое и патофизиологическое значение Ig разных классов

4. Методы определения концентрации основных изотипов иммуноглобулинов (реакция простой радиальной иммунодиффузии по Манчини).

5. Реакции серологического метода и их значение в детекции антител.

Литература

1. Пиккеринг У.Ф., Современная аналитическая химия, пер. с англ., М., 1977

2. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов, методические указания. Новик А.А., Цыган В.Н., Никитин В.Ю., Соколова Е.Д., Жданов К.В.,

3. Огарков П.И., Лобзин Ю.В.,Жоголев К.Д., Малышев В.В.,ТокмаковВ.С., Сухина И.А. Издательство: Министерство обороны РФ, Главное Военно-Медицинское управление, Москва, 2002.Страницы: 74.

4. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

5. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

6. Crowther, J. R. 1995. ELISA. Theory and Practice. Methods Mol. Biol. 42:1-223.

Engvall, E., and P. Perlmann. 1971. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. I mmunochem.8:871-874.

7. Scheffold A, Kern F. Recent developments in flow cytometry. J Clin Immunol. 2000;20:400

8.Kirschfinr M. /DMW: Dtsch. Med. Wochenschr. – 1994 – 119 - №9 – p. 307-310

Лабораторная работа № 4