Используемые флурохромы в иммунофлуоресценции

Флуорохром	Пик возбуждения (нм)	Пик эмиссии (нм)	Лазер* (нм)	Цвет флуоресцентной эмиссии
FITC, Fluorescein Isothiocyanate			488 A	зеленый
PE, R-Phycoerythrin			488 A	желтый
TX, Texas Red				оранжевый
APC, Allophycocyanin			630 H	красный
PE-Cy7, Phycoerythrin-cyanine7 conjugate			488 А	инфракрасный

Примечание: * А – аргон -ионный лазер, Н – гелий-неонный лазер

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлуоресценции получила наиболее широкое применение. Учет проводится на люминесцентном микроскопе или проточном цитометре. Люминесцентная микроскопия для иммунофенотипирования далеко не лучший вариант вследствие трудоёмкости (любое фенотипирование - 1 исследование- предполагает определение не менее 4-5 маркеров) и лучевой нагрузки на глаза лаборанта. Этот недостаток был преодолён с разработкой проточных цитометров и лазерных сорти­ровщиков клеток.

Проточная цитометрия позволяет: 1) устанавливать фенотип клеток в диагностике патологии иммунной системы, гемобластозов, анемий; 2) анализировать анеуплоидные клеточные клоны, что является важным критерием при диагностике злокачественных опухолей; 3) оценивать распределение клеток по фазам клеточного цикла, т.е. пролиферативную активность популяций.

Проточный цитометр можно представить как усложненный микроскоп со способностью к бы­строму количественному анализу множества свойств одиночных клеток, суспендированных в жидкой среде. Клетки по одной проходят через специальную камеру, пересекая пучок света высокой интенсив­ности (лазерный пучок), со скоростью несколько тысяч в секунду. Каждая клетка, проходя через луч света, испускает рассеянные и флуоресцентные световые сигналы (см. рисунок 4.1). Эти сигналы регистрируются при помощи светочувствительных датчиков, усиливаются и при помощи аналого-цифровых преобразовате­лей переводятся в цифровые значения. Для переработки и хранения информации используются компьютеры. Ряд приборов, называемыми сортерами, оснащены устройством для препаративной сортировки клеток, при помощи которого объекты могут быть отсортированы в разные пробирки. Все клеточные сортеры являются проточными цитометрами, но не все проточные цитометры обязательно являются сортерами. Сортировка пока используется только в научных целях, но имеет очень важное преимущество - интересующие исследователя объекты могут быть получены в чистом виде и изучены с помощью других методов.

После разработки первых проточных лазерных цитометров особое внимание уделялось поиску и созданию новых флуорохромов, аточнее подбор флуорохромов, возбуждающихся на разных длинах волн. Этот подход позволил создать и применить для фенотипирования 2-3 типов МАТ, меченных разными флуорохромами (пример результата такого анализа представлены на рисунке 5.2).

 

Рисунок 4.1 Схема флуоресцентного клеточного сортера «FACS II»

 

В этом случае метод не только даст информацию о процентном содержании клеток, экспрессирующих определенный рецептор, но определяет число клеток, несущих сочетание 2-4 маркеров (разрабатываются системы для одновременного учета 7-11 маркеров!). Эти современные методы позволяют давать комплексную оценку иммунологического фенотипа ИКК, причем система учета автоматизирована и объективна.

Собственно процедура иммунофенотипирования иммунокомпетентных клеток заключается в постановке реакции иммунофлуоресценции. При учете на люминесцентном микроскопе маркирование клеток МАТ проводят, используя очищенную от других типов клеток суспензию мононуклеаров и вариант непрямой РИФ. При учете на проточном цитофлуориметре чаще маркирование проводят с использованием цельной крови в варианте прямой РИФ.

Протокол постановка прямой РИФ

(с регистрацией на цитофлуориметре)

Реакцию проводят на выделенной из крови суспензии мононуклеаров в концентрации 2,5-5,0×10⁶ клеток/мл или с использованием цельной крови.

1. В пластиковую пробирку (12×75 мм) вносят 100 мкл крови, добавляют 10 мкл МАТ, меченных флуорохромом, тщательно перемешивают и инкубируют в темноте при комнатной температуре 30 минут.

2. В образец вносят лизирующий RBC раствор (0,84 М NH₄Cl в буферном растворе) на 3 – 5 минут, затем добавляют 2 мл PBS.

3. Центрифугируют пробирку, отбирают супернатант, а к осадку клеток добавляют 0,5 мл 2% раствора параформальдегида.

4. Регистрируют реакцию на проточном цитофлуориметре.