Объемы крови необходимые для исследования в зависимости от задач иммунодиагностики и применяемых методов

 

Исследуемые факторы	Исследуемые параметры	Методы	Объем крови
1. Лимфоциты	Мембранные маркеры для определения популяций лимфоцитов (CD3,CD4,CD8,CD19, CD56, HLA-DR)	розеткообразование	Не менее 5 мл
проточная цитометрия с возможностью 1-цветной метки	Около 1 мл
- " - с возможностью 2-цветных меток	Не более 0,5 мл
- " - с возможностью 3- 4-цветных меток	0,1 – 0,2 мл
Функциональная активность (пролиферативный тест, продукция цитокинов и др.)	из суспензии сепа-рированных мононуклеаров	Не менее 5 мл
из цельной крови	1 мл
2.Нейтрофилы	Фагоцитарная активность	Из суспензии сепари- рованных нейтрофилов	Не менее 5 мл
В цельной крови	Не более 0,2 мл
Метаболическая активность (в НСТ-тесте)	Из суспензии сепарированных нейтрофилов	Не менее 5 мл
В цельной крови	Не более 0,2 мл
При микроскопическом учете	Не более 0,2 мл
При спектрофотометрическом учете	Не менее 1 мл
3.Иммуно- глобулины	Уровни при определении классовой специфичности (IgG,A,M)	Метод Манчини	2,5 мкл на каждый класс
Турбидиметрия или нефелометрия	100 мкл на каждый класс
Уровни при определении субклассовой специфич-ности (IgG1,2,3,4), а также - IgE	ИФА, турбидиметрия или нефелометрия	100 мкл на каждый класс

 

Хранение биологического материала, предназначенного для

Иммунодиагностического исследования

 

1. Кровь, предназначенная для исследования ИКК должна подвергаться обработке в максимально короткие сроки. Сохранение образца в течение 1-4- часов можно производить при комнатной температуре, желательно в темноте. При более длительном промежутке времени образец следует сохранять при температуре +4 °С. В этом случае могут происходить изменения функциональных свойств клеток, особенно нейтрофилов (охлаждение клеток приводит к их агрегации, снижению фагоцитарной активности и др. изменениям). В то же время образец крови, предназначенный для исследования иммунологического фенотипа лимфоцитов методом проточной цитометрии сохраняет свои свойства при таком режиме хранения не менее 3 – 7 суток.

2. При необходимости длительного сохранения клеточного материала образец крови или сепарированных лимфоцитов замораживают в жидком азоте с использованием специальных буферных консервирующих смесей.

3. При хранении образца крови (плазмы или сыворотки) нужно учитывать скорость катаболизма исследуемых иммуноактивных молекул. Так, период Т_1/2 молекул антител классов IgG составляет 21 сутки, IgM и IgA – 5 – 7 суток. Это означает, что при хранении образца биологического материала при температуре +4 °С (а не в замороженном состоянии) получаемая информация будет характеризоваться достоверностью в течение перечисленного выше времени. Однако данный подход совершенно непригоден для исследования цитокинов, а также компонентов СК.

4. Сыворотка крови, используемая для определения концентрации иммуноактивных молекул, может длительно храниться при −18−40 °С. Однако, один и тот же образец не должен подвергаться повторному замораживанию. Кроме этого, при длительном хранении замороженных образцов сыворотки и плазмы крови следует учитывать возможность образования холодовых преципитатов и усиления испарения воды из образца, что изменяет концентрацию и/или активность исследуемых гуморальных факторов.

 

Получение сыворотки крови

 

Взятый у пациента образец крови помещают в сухую чистую пробирку для образования сгустка, т.е. свертывания крови. Этот процесс осуществляется в течение 30-60 мин при инкубации образца при комнатной температуре или при 37º С. После образования сгустка, его отделяют от стенок пробирки, обводя сухой стеклянной палочкой, центрифугируют 10 минут при 350 - 400 g (1500 об/мин) и полученную сыворотку отбирают в чистую пробирку. Сыворотку во избежание эффекта действия неоднок­ратных замораживаний и размораживаний в случае длительного хранения разливают в несколько микропробирок и хранят при -20 °С.

Методы сепарации клеток

 

Многие иммунодиагностические методы нуждаются в очищенной от ненужных типов клеток суспензии. Поэтому особое значение имеют методы сепарации клеток из порции периферической крови (или другого биологического материала). В принципе, все методы сепарации можно условно разделить на три большие группы в соответствии с рисунком 1.3. Эти методы часто дополняют друг друга и используются в комплексе. Комбинация методов сепарации клеток регламентируется задачами диагностической процедуры. В настоящее время разработаны модификации практически всех методик исследования клеток с использованием разных методов сепарации или вовсе без них.

При проведении сепарации клеток нужно учитывать:

1) существенные потери клеток, причем не только в количестве, но и в качестве. Так, ряд функциональных состояний клеток (активация, патологические изменения) сопровождается увеличением их чувствительности к физико-химическим воздействиям, приводящим к разрушению этих клеток и выведению их из-под контроля диагностического теста, а значит – и к утрате диагностически важной информации;

2) изменения функциональных характеристики клеток в процессе сепарации, что также изменяет диагностическое значение полученных результатов.

Среди методов сепарации (выделения, разделения, сортинга) клеток используются различные принципы и соответствующие им методы в соответствии с таблицей 1.3.

 

Рисунок 1.3. Основные методы сепарации клеток

Таблица 1.3