Генная инженерия растений с помощью Agrobacterium. Прямые методы генетической трансформации растений.

Непосредственный перенос гена в чужеродный геном получил название генетическая трансформация. Система, обеспечивающая такой перенос, получила название вектор.

Плазмидные векторы. В качестве векторов используются плазмиды бактерий и для трансформации растений чаще всего Ti – плазмида (от англ. tumor induction) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. В природных условиях Agrobacterium tumefaciens проникают в клетки корней растений и там размножаются. При этом часть плазмидной ДНК (T-ДНК) встраивается в хромосомы поврежденных (зараженных) клеток, индуцируя образование галлов (опухолей). Это естественный вектор переноса ДНК. При трансформации растений используют так называемую разрушенную Ti-плазмиду, которая лишена онкогенов, вызывающих образование галлов. Вместо этих генов в плазмиду ―встраивают интересующие исследователя гены, а также так называемые репортерные гены, позволяющие убедиться во встраивании T-ДНК в геном растения, в результате экспресссии которых, трансформированная клетка становится устойчивой к антибиотикам канамицину, метатрексиату и гигромицину В.

При культивировании трасформированных клеток на среде с данным антибиотиком, выживают только клетки, у которых Т-ДНК включена в геном. Помимо ―встроенных генов Ti-плазмида должна содержать гены vir-областей, обеспечивающих сам процесс встраивания T-ДНК в хромосому. В последующем была создана, так называемая, бинарная система трансформации, состоящая из небольшой, реплицирующейся как в E.coli, так и в A.tumefaciens, плазмиды, несущей переносимые гены, и Ti-плазмиды, несущей vir-гены с делетированной Т-ДНК. Считается, что с использованием A.tumefaciens легче трансформировать двудольные растения (горох, табак и т.п.), чем однодольные (пшеница, кукуруза). Но это уже зависит от избранного метода трансформации. Вообще же к настоящему времени создано огромное число плазмид, которые используются в качестве векторов при трансформации как растений, так и животных.

Вирусные векторы. В целях трансформации растений используют и векторы, сконструированные на основе растительных вирусов. Однако их набор ограничен. Это объясняется тем, что у большинства растительных вирусов генетическим материалом является РНК, и только у некоторых, как вирус мозаики цветной капусты (СаМV) и группы вирусов Gemini, наследственным материалом служит ДНК. Недостатком вирусных векторов является ограниченная протяженность встраиваемых генов (от 200 до 500 п.н.) и высокая специфичность по отношению к видам растений. Так, вирус мозаики цветной капусты можно использовать только при трансформировании растений, относящихся к семейству крестоцветных.

Безвекторные системы.

Генная пушка. Этот метод носит название «биологической баллистики». Он заключается в обстреле из вакуумной пушки (генная пушка) суспензий клеток растений, протопластов и каллусов. Обстрел растительных тканей производят частицами золота или вольфрама (диаметр 0,6 – 1,2 мкм), на которые нанесена чужеродная ДНК. Растительные клетки располагают на специальной целлофановой пластине. Частицы металла пронизывают клетки, оставляя в них ДНК. Трансформируется при этом около 10-15% клеток, часть из которых регенерирует в нормальные растения. И хотя процесс трансформации все же носит случайный характер, к настоящему времени этим способом получены трансгенные растения, преимущественно из однодольных культур (кукуруза, рис, пшеница и др.).

Метод электропорации. Это один из методов прямого введения ДНК в клетку. Растительные клетки погружают в среду с находящейся в ней чужеродной ДНК. Через эту среду пропускают (доли секунды!) электрический ток с напряжением 250-300 В. Через расширившиеся поры ядерной мембраны чужеродная ДНК проникает в ядра и включается в хромосомы.

Микроинъекции. С помощью микроигл (наружный диаметр 2 мкм) чужеродную ДНК вводят в ядра клеток, закрепленных на стекле при помощи полилизина.

Использование «агентов слияния». В качестве «агентов слияния» используют положительно заряженные сферы липидов (липосомы), которые обволакивают векторную ДНК, защищая ее от действия нуклеаз. Находящаяся в липосомах ДНК проникает с их помощью в растительные клетки и включается в геном.