Вплив рн середовища на активність ферментів

Мета: Дослідити вплив рН реакційного середовища на активність ферменту – α-амілази та визначити оптимум рН для дії α-амілази.

Теоретична частина: Активність ферментів залежить від рН середовища. Оптимальне значення рН для дії більшості ферментів складає 6,0 – 8,0. Винятком є шлунковий фермент пепсин, який активний при рН менше 2.

Прилади та матеріали: водяний термостат, термометр, рН-метр, розчин з молярною концентрацією калій дигідрогенфосфату 0,07 моль/л, розчин з молярною концентрацією натрій гідрогенфосфату 0,07 моль/л, розчин з масовою часткою крохмалю 0,5 %, йод у розчині з масовою часткою калій йодиду 3 %, стандартні буферні розчини, досліджувана сироватка крові.

 

Хід визначення

За завданням викладача готують 4 – 5 буферних розчинів із певним значенням рН, користуючись таблицею 13.

 

Таблиця 13

Склад стандартних буферних розчинів

 

Na2HPO4, мл	KH2PO4, мл	рН		Na2HPO4, мл	KH2PO4, мл	pН
0,00	10,0	4,49		6,00	4,00	6,98
0,10	9,90	4,94		7,00	3,00	7,17
0,25	9,75	5,29		8,00	2,00	7,38
0,50	9,50	5,59		9,00	1,00	7,73
1,00	9,00	5,91		9,50	0,50	8,04
2,00	8,00	6,24		9,75	0,25	8,34
3,00	7,00	6,47		9,90	0,10	8,67
4,00	6,00	6,64		10,0	0,00	9,18
5,00	5,00	6,81

Дві бюретки заповнюють розчином з молярною концентрацією натрій гідрогенфосфату 0,07 моль/л і розчином з молярною концентрацією калій дигідрогенфосфату 0,07 моль/л. Змішуванням різноманітних об'ємів того та іншого розчинів одержують суміші з певним значенням рН.

Точні значення рН визначають на рН-метрі або на йономірі зі скляним індикаторним електродом (розд. 2.4).

Для цієї роботи можливо використати серію стандартних буферних розчинів, попередньо визначивши значення рН на рН-метрі. Бажано підбирати розчини з таким значенням рН, щоб діапазон рН охоплював кисле, нейтральне та лужне середовище.

У пробірки вносять по 5 мл буферного розчину з певним значенням рН, 1 мл розчину з масовою часткою крохмалю 0,5 %, 1 мл розведеної в 10 разів сироватки і старанно перемішують вміст за допомогою скляної палички. Пробірки вміщують у водяний термостат, нагрітий до 37 ⁰С, і через 3 – 5 хвилин у всі пробірки капають декілька крапель розчину йоду (розчин у пробірках забарвлюється у синій колір). Через кожні 2 – 3 хвилини проводять спостереження за зміною забарвлення. Для кожної із пробірок відзначають час, коли зникне синій колір (закінчення амілолітичного розщеплення крохмалю).

Отримані результати виражають графічно: по осі абсцис завдають значення рН дослідів, а по осі ординат – час розщеплення крохмалю при відповідних значеннях рН.

Роблять висновок про залежність активності ферменту від значення рН і визначають оптимум рН для дії α-амілази.

Лабораторна робота № 14

Вплив активаторів та інгібіторів

на активність ферменту α-амілази

 

Мета: Дослідити вплив хімічних речовин на активність ферменту – α-амілази.

Теоретична частина: Активаторами ферментів є йони металів, органічні кислоти, самі ферменти (аутоактивація). Інгібуючу дію виявляють концентровані мінеральні кислоти, солі важких металів. Активатором α-амілази є натрій хлорид, а інгібітором – купрум (II) сульфат. Вплив цих речовин на активність α -амілази визначають за ступенем гід­ролізу крохмалю під впливом ферментів у присутності солей.

 

Прилади та матеріали: водяний термостат, досліджувана сироватка крові, розчин з масовою часткою крохмалю 0,5 %, розчин з масовою часткою йоду 0,1 % в розчині з масовою часткою калій йодиду 0,2 %, розчин з масовою часткою натрій хлориду (NaCl) 1 %, розчин з масовою часткою купрум (II) сульфату (CuSO₄) 1 %.

Хід визначення

здійснюють за табл. 14. Проби досліджують у хімічних пробірках.

 

Після ретельного перемішування пробірки занурюють у термостат при температурі 37 – 38 ⁰С. Через 5 хвилин інкубації додають по 3 краплі розчину йоду. Рідина у першій пробірці забарвлюється у червоний або фіолетовий колір; у другій – у червоний або жовтий; у третій – у синій.

За отриманими результатами роблять висновок про вплив різноманітних солей на активність ферменту – α-амілази.

Таблиця 14

Вміст досліджуваних проб

 

Інгредієнти, мл	Проба №1	Проба №2	Проба №3
Дистильована вода	2,5
розчин з масовою часткою NaCl 1 %	–	0,5	–
розчин з масовою часткою CuSO4 1 %	–	–	0,5
Інкубують протягом 3 – 5 хвилин при 37^0С
Сироватка крові	0,1	0,1	0,1
Перемішують
розчин з масовою часткою крохмалю 0,5 %

 

Лабораторна робота № 15