Якісне визначення глюкози в біологічних рідинах.

Реакція Тромера

 

Мета: Вивчити механізм взаємодії глюкози з купрум(II) сульфатом у лужному середовищі.

 

Теоретична частина: Розчини гексоз (наприклад, глюкози або фруктози) у лужному середовищі відновлюють купрум(II) оксид у процесі нагрівання в купрум(I) оксид, а самі окиснюються до альдонових кислот. Цю реакцію за участю глюкози можна записати рівнянням:

 

CH₂OH(CHOH)₄CОН + 2CuSO₄ + 5NaOH →

CH₂OH(CHOH)₄CООNa + Cu₂O↓+ 2Na₂SО₄ + 3H₂O.

Принцип методу: глюкоза в лужному середовищі відновлює купрум (II) оксид (CuO) в купрум(I) оксид (Cu₂O).

Матеріали та реактиви: біологічна рідина, що містить глюкозу (сеча), розчин з масовою часткою натрій гідроксиду 0,5 %, розчин з масовою часткою купрум (ІІ) сульфату 0,5 %, пробірки, скляні палички, піпетки градуйовані на 5 мл, 1 мл, штатив для пробірок, пальник.

 

Хід визначення

У пробірку до 3 мл сечі додають 1 мл розчину натрій гідроксиду і 5 крапель розчину купрум (ІІ) сульфату. Спос­терігається поява осаду купруму (II) гідроксиду, що у процесі перемішування або струшування розчиняється, а розчин набуває блакитного забарвлення. Під час його обережного нагрівання в полум'ї пальника до кипіння спостерігається випадіння жовтого осаду купруму (I) гідроксиду чи червоного осаду купрум(I) оксиду.

За результатами досліду зробити висновок про наявність глюкози в досліджуваних біологічних рідинах, сформулювати клініко-діагностичний висновок (стор. 110).

Лабораторна робота № 18

Визначення глюкози в біологічних рідинах

глюкозооксидазним(уніфікованим) методом

Мета: Опанувати кількісний колориметричний глюкозооксидазнийметод визначення глюкози в сироватці крові та за отриманими результатами зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 110).

Принцип методу: Глюкоза у присутності ферменту – глюкозооксидази окиснюється киснем повітря до глюконової кислоти:

 

CH₂OН–(CHOН)₄–СНО+О₂+Н₂О→CH₂OН–(CHOН)₄–СООН+Н₂О₂.

глюкоза глюконова кислота

 

Перекис водню окиснює хромоген, перетворюючи його в забарвлену у синій колір сполуку. Реакція проводиться у термостаті при температурі 37 ⁰С протягом 15 хвилин, потім зупиняється введенням у розчин сульфатної кислоти. Сульфатна кислота перетворює жовте забарвлення у червоне. Стабільність забарвленого комплексу зберігається протягом 1 години.

Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК–2, піпетки градуйовані на 5 мл, 1 мл, 0,1 мл, штатив для пробірок та піпеток, досліджувана сироватка крові.

Робота проводиться з використанням готового набору реактивів.

Реактиви: склад набору: суха суміш реактивів (1 флакон), розчин пероксидази в стабілізаторі (1 амп.), розчин хромогену (1 амп.), розчин з масовою часткою цинк сульфату 10 % (10 мл), барій гідроксид (1 г), спиртовий розчин з масовою часткою фенолфталеїну1 % (1 мл), стандартний розчин глюкози 10 ммоль/л (1 амп.);

розчин з масовою часткою сульфатної кислоти 15 % (не комплектується).

 

Готування робочих розчинів

1. Ензимний розчин. У хімічний стакан влити 50 мл фізіологічного розчину, кількісно додати вміст флакону сухої суміші реактивів, додати розчин хромогену, розчин пероксидази, перемішати до повного розчинення кристалів. Відфільтрувати через вату. Зберігати в холодильнику до 10 днів.

2. Розчин з масовою часткою сульфатної кислоти Н₂SO₄ 15 % готується у лабораторії.

3. Стандартний розчин глюкози (з молярною концентрацією глюкози 10 ммоль/л) готовий до роботи.

4. Фізіологічний розчин – розчин з масовою часткою натрій хлориду NaCl 0,9 %.

Хід визначення

Приготувати розчин сироватки у фізіологічному розчині: у хімічну пробірку внести 1 мл фізіологічного розчину, додати 0,05 мл сироватки, перемішати. Подальший аналіз здійснюють за таблицею 18.

 

Таблиця 18

Склад робочих розчинів та хід визначення

 

Інгредієнти, мл	Проба	Еталон	Контроль
Ензимний розчин	1,0	1,0	1,0
Розчин сироватки у фізіологічному розчині	0,50
Стандартний розчин глюкози		0,05
Фізіологічний розчин			0,05
Перемішують і інкубують протягом 15 хвилин при 37 ^0С
Розчин Н2SO4	1,0	1,0	1,0

Перемішують і через 5 хвилин вимірюють екстинкцію за допомогою колориметру фотоелектричного кон­центраційного КФК–2 у кюветах із товщиною шару 5 мм за довжини хвилі 540 нм (зелений світлофільтр). Робота з приладом описана у розділі 2.1.1.

Розрахунок концентрації глюкози у сироватці крові виконують за формулою:

,

де – концентрація глюкози у сироватці крові (ммоль/л); С_ст. – концентрація глюкози у стандартному розчині (10 ммоль/л); – екстинкція досліджуваної проби; – екстинкція стандартної проби.

 

Норма глюкози в крові: 2,77 – 5,55 ммоль/л.

Примітка: якщо концентрація глюкози в крові виявиться 15 ммоль/л, пробу необхідно розвести фізіологічним розчином у 2 рази, провести дослідження і результат помножити на 2.

Лабораторна робота № 19