Колориметричний метод визначення активності

аспартатамінотрансферази у сироватці крові
(за Райтманом – Френкелем)

Мета: Визначити активність аспартатамінотрансферазиу сироватці крові динітрофенілгідразиновим методом та за отриманими даними зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 97).

Принцип методу: У результаті амінування 2–оксо-глутарової кислоти α–аспарагіновою кислотою, що відбувається під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ), утворюються α–глутамінова і щавлевоацетатна кислоти, остання з яких здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в піровиноградну кислоту. Визначення основане на вимірі екстинкції 2,4-динітрофенілгідразонів 2-оксоглутарової і піровиноградної кислот у лужному середовищі. Оскільки забарвлений гідразон піровиноградної кислоти має більш високий коефіцієнт молярної екстинкції, спостерігається прямопропорційна залежність екстинк-ції реакційного розчину від активності ферменту.

Лабораторна робота проводиться з використанням готового набору реактивів.

Прилади та матеріали: водяний термостат; фотометр аналітичний медичний МЕФАН–8001; досліджувана сироватка крові.

Склад готового набору реактивів:

· Субстратно-буферний розчин: фосфатний буфер 0,1 моль/л, α–аспарагінова кислота 0,1 моль/л, 2–оксо-глутарова кислота 2 ммоль/л, (50 мл).

· Розчин 2,4-динітрофенілгідразину 1 ммоль/л в хло­ридній кислоті концентрацією 1 моль/л (допускається наявність дрібнодисперсних домішок), (50 мл).

· Калібрувальний розчин – натрій піровинограднокислий концентрацією 2 ммоль/л (220 мкг/мл), що відповідає 176 мкг/мл піровиноградної кислоти, (5 мл).

· Натрій гідроксид 8,0 г (1 флакон). Обережно!

Приготування робочих розчинів

1. Розчин з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,4 моль/л: вміст флакону кількісно переносять в мірну колбу на 500 мл і доводять розчин до мітки дистильованою водою. Розчин стійкий.

2. Калібрувальний розчин готовий до роботи. Після відкриття ампули допускається його збереження при кімнатній температурі протягом 12 годин.

3. Субстратно-буферний розчин готовий до роботи. Після відкриття флакону допускається його збереження при температурі 2 – 10 ⁰С протягом 2 тижнів.

4. Розчин 2,4–динітрофенілгідразину готовий до роботи. Розчин стійкий.

Хід визначення здійснюють за схемою, що приведена в таблиці 16.

Таблиця 16

Вміст досліджуваних проб

 

Інгредієнти, мл	Мікроаналіз	Макроаналіз
Дослід-жувана проба	Холос-та проба	Дослід-жувана проба	Холоста проба
Субстратно-буферний розчин Фізіологічний розчин	0,1   –	0,1   0,02	0,4   –	0,4   0,08
Інкубують протягом 3 хвилин при 37^0С
Сироватка крові	0,02	–	0,08
Інкубують протягом 30 хвилин при 37^0С
Розчин 2,4–динітро-фенілгідразину	0,1	0,1	0,4	0,4
Витримують 20 хвилин при кімнатній температурі
Розчин NaOH, 0,4 моль/л	1,0	1,0	4,0	4,0

Витримують 10 хвилин при кімнатній температурі і вимірюють екстинкцію досліджуваної проби проти холостої (розд. 2.1.4) за довжини хвилі 490 – 540 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Розрахунок активності здійснюють за калібрувальним графіком, що будують у відповідності з таблицею 17.

Таблиця 17

Склад стандартних розчинів

 

Інгредієнти, мл	Калібрувальні точки	Контр. проба
Субстратно-буферний розчин Калібрувальний розчин натрій пірувату Розчин 2,4-динітрофеніл-гідразину	0,475     0,025     0,50	0,45     0,05     0,50	0,425     0,075     0,50	0,40     0,10     0,50	0,375     0,125     0,50	0,50     –     0,50
Витримують 20 хвилин при кімнатній температурі
Розчин NaOH, 0,4 моль/л	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Вміст піровиноградної кислоти в калібрувальній пробі, мкмоль	0,05	0,10	0,15	0,20	0,25	0,0
Активність АсАТ у мкмоль/(год·мл) або мккат/л	1,0 0,278	2,0 0,556	3,0 0,833	4,0 1,11	5,0 1,39	0,0 0,0

 

Витримують 10 хвилин при кімнатній температурі. Вимірюють екстинкцію калібрувальних проб проти конт­рольної за довжини хвилі 490 – 540 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм (розд. 2.1.4). Будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис величини активності аспартатамінотрансферази (мкмоль піровиноградної кислоти на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації), на осі ординат – екстинкцію. Лінійність калібрувального графіка зберігається до розміру екстинкції 0,35. Якщо розмір екстинкціївище 0,35, то сироватку потрібно розбавити 5 % розчином альбуміну, який готують на фізіологічному розчині. Результат множать на коефіцієнт розведення.

Норма активності аспартатамінотрансферази:

0,1 – 0,45 мкмоль/(год.·мл) при 37 ⁰С.