Тема 20. Консервация клеточных культур

Несмотря на то, что некоторые клеточные культуры предлагалось сохранять при положительной или умеренно низкой температуре только консервация в условиях глубокого замораживания оказалось высокоэффективной и широко используется в практике работы с культивируемыми клетками.

В настоящее время как у нас в стране, так и за рубежом накоплен достаточный опыт создания и поддержания оптимальных условий для длительного сохранения жизнеспособности клеток в замороженном виде, разработаны простые и удобные в обращении емкости для хранения клеток в жидком азоте и его парах, установки для программного замораживания. Консервация клеточных линий и штаммов при сверхнизкой температуре имеет ряд конструктивных преимуществ и привлекательных возможностей, в частности:

- экспериментировать с клетками, свойства и характеристики которых, а также история происхождения и культивирования, хорошо изучены и известны. При этом следует иметь в виду, что замораживание до сверхнизкой температуры, длительное хранение в этих условиях и последующее оттаивание клеточной взвеси могут обладать определенным селективным действием на клеточную популяцию.

- создать условия для проведения сравнительных исследований со стандартными клетками на том же самом пассажном уровне при постановке экспериментов периодически, с интервалом в несколько лет;

- консервирование позволяет сохранять клетки с уникальным генотипом, получение которых в обычных условиях затруднено или невозможно;

- устраняется необходимость затраты больших материальных и трудовых ресурсов на серийное пассирование с целью поддержания клеточной линии;

- консервирование в жидком азоте дает возможность проведения в стандартизированных условиях разностороннего контрольного исследования клеточного штамма, в первую очередь диплоидных клеток, рассматриваемых в качестве перспективного субстрата для производства вирусных вакцин;

- устраняется опасность потери клеточной культуры в результате контаминации, аварии, изменения свойств клеток или окончания срока их жизни.

Для снижения повреждения клеток в процессе замораживания и оттаивания используют криозащитные вещества различной природы. Наибольшей популярностью пользуются глицерин и диметилсульфоксид, которые пригодны для большинства известных клеток животныхи человека, обладают примерно равной эффективностью и добавляются к питательной среде в концентрации 5-10%.

При температуре-196°С жизнеспособность законсервированной клеточной популяция может сохраняться неограниченно долго. Процент жизнеспособности клеток после расконсервирования варьирует (зависимости от условий, длительности хранения, от природы клеток) и составляет обычно 60-90. В последние годы многие лаборатории предпочитают хранение клеток не в самом жидком азоте, а в его парах.

Наиболее стабильные результаты получают при использовании установок для программного замораживания. Среди множества режимов замораживания, предложенных и испытанных для различных типов клеток, простотой и эффективностью отличается и наиболее широко применяется охлаждение от 10 до -20 - -30°С со скоростью 1-3°С в мин, за которым следует ускоренное охлаждение (10-30 °С/мин) до температуры -90 -120 °С, после чего ампулы с клеточной взвесью переносят непосредственно в жидкий азот.

При отсутствии установок для программного замораживания можно пользоваться определенными схемами с регулированием скорости охлаждения вручную. Хорошие результаты дают 2 простых способа.

Первый заключается в том, что ампулы с клеточной взвесью, размещенные в специальном держателе, вносят в пары азота в небольшом дюаре, располагая в той расчетно найденной точке, в которой скорость охлаждения клеток соответствует приблизительно 1°С мин. Через сутки ампулы погружают непосредственно в жидкий азот.

При использовании второго способа ампулы с клеточной взвесью укладывают в емкость из пенопласта размером 30x30x30 см, заливают спиртом и помещают на ночь в рефрижератор, имеющий температуру -65 -70 °С, или ящик с сухим льдом. На следующий день ампулы переносят в жидкий азот.

Оттаивание клеток следует проводить по возможности быстро, помещая извлеченные из жидкого азота ампулы в подогретую до 37 - 40 °С слегка перемешиваемую воду.

Принципиально важное значение для сохранения жизнеспособности клеток может иметь процесс эквилибрации их в среде с криозащитными агентами в течение нескольких часов при подготовке к замораживанию, а также процедура диэквилибрации, проводимая после оттаивания.

Известен способ хранения изолированных клеток и тканей наслоением на клетки 10 мл автоклавированного минерального масла с последующим их хранением при 5 °С.

В связи с широким использованием низких температур (-196 °C) для хранения клеточных культур особый интерес представляет вопрос о репарации (восстановлении функций) клеток после криоконсервации. Показано, что использование обогащенных сред способствует репаративным процессам после замораживания - оттаивания.

Фирмой Biotech Reseach Laboratories (США) получено путем ок-сиэтилирования глицерина, его оксиэтильное соединение, не токсичное обладающее криозащитным эффектом в отношении перевиваемых клеточных линий.

Возможность почти неограниченного по времени сохранения клеток в жидком азоте позволяет широко использовать клеточные культуры в практической работе.

При замораживаний больше всего клеток погибает в интервале температур от -10 до -30 °С. Для снижения этого нежелательного процесса используют криопротекторы. К клеткам, находящимся в сывороточной среде; добавляют 10 %-ный диметилсульфоксид или 7%-ный глицерин, или смесь этих веществ. Затем их выдерживают в течение 10 мин при 10°С, после чего помещают в замораживатель и охлаждают до -70 °С, а только затем переносят в жидкий азот. Оттаивание осуществляют путем погружения ампул на 1 мин в водяную баню при 33 - 39 °С.

Разработан криопротектор на основе 0,1 %-ной метилцеллюлозы и10%-ного диметилсульфоксида для замораживания гибридом в бес сывороточных средах.

При подготовке клеток любого типа к замораживанию следует учи­тывать тот факт, что при подготовке к длительной криоконсервации выживает около 80 % клеток. После размораживания выживает 90 -95% лимфоцитов и 40 - 60 % гранулоцитов. То же имеет место при криоконсервации гибридомных и других клеточных линий.

Показано, что при криоконсервации в присутствии криопротектора наблюдается незначительное снижение выживаемости, но увеличивается синтез ДНК и частота хромосомных нарушений, однако на 7 - 14-е сутки после размораживания наблюдается нормализация и восстановление этих параметров.

Культуры клеток птиц широко используют для производства вирусных вакцин. Перевиваемые линии клеток, как правило, контаминированы, поэтому особое значение приобретают первичные культуры. Однако и они могут быть контаминированы реовирусами, аденовирусами и прочими агентами. Возникает необходимость длительного консервирования клеток птиц и клеточного сырья.

Изучена возможность криоконсервирования клеток кур, индеек и гусей в присутствии различных криопротекторов. Было установлено, что для замораживания клеток птиц наиболее подходящим криопротектором является диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 5-15 %, глицерин эффективен только в низких концентрациях – 5-15%, поливинилпирролидон (ПВП) и декстран оказались непригодными для этих целей. После хранения первичных клеток и субкультур фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и почек эмбрионов кур (ПЭК) с 10,% ДМСО при - 70°С или в жидком азоте (-196°С) в течение 9-12 месяцев уровень выживания составляет 50% и более.

Одним из критических факторов успешного криоконсервирования клеток является скорость замораживания. Показано, что оптимальным является снижение температуры на 1⁰С в минуту. Этого можно достигнуть только при наличии специального оборудования. Клеточные культуры, полученные из клеток, хранившихся при минусовых температурах, остаются чувствительными ко многим вирусам болезней птиц. Таким образом, они могут заменять свежие клетки. Яйца без специфических патогенных агентов (СПФ) не всегда доступны, поэтому консервирование клеток позволяет иметь необходимый запас. Кроме того, появляется возможность проведения качественного контроля и стандартизации культур первичных клеток.

Изучено влияние условий хранения вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/1. Данные, полученные в ре­зультате этих опытов, показывают, что хранение культурального вируса при

-50 °С не снижает его инфекционности в течение трех месяцев, при -7 °С в течение двух месяцев; Хранение при температурах +4, +20 и +37 ⁰С снижает инфекционность вируса с 5,5 lg ЛД_50/мл (в исходном препарате) уже через один месяц до 5,0; 2,25; и 1,25 lg ЛД _50/мл соответственно.

Комплементсвязывающая активность культурального вируса снижается через один месяц хранения с 1:32 (в исходном вирусе) до 1:24- 1:8 при всех температурах кроме +20⁰С.При температурах +20° и +4 комплементсвязывающая активность сохраняется на довольно высоком уровне (1:24) в течение трех месяцев хранения.

Преципитирующая активность вируса не снижается в течение пяти-шести месяцев хранения при температурах -50, -7 и +4°С. В процессе хранения при температурах +20 и +37°С преципитирующая активность вируса снижается в течение трех месяцев и проявляется только в не разведенных препаратах.

Гемагглютинирующая активность вируса бешенства не меняется точение четырех месяцев при температурах -50 и -7 °С. Хранение вируса при +4°С снижает его гемагглюитинирующую активность уже через один месяц с 1:16 (в исходном варианте) до 1:12, а при температурах -20 и 37 °С с 1:16 до 1:4.

Изучено влияние условий хранения на биологические свойства очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства, Вирус очищали и концентрировали в 15 раз адсорбцией-элюцией на геле фосфата алюминия и высокоскоростным центрифугированием Препараты имели титр инфекционности 5,75 lg ЛД_50/мл и содержали 2,5 мг/мл белка.

Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что инфекционность препаратов очищенного и концентрированного вируса бешенства не снижается в течение трех месяцев при температуре -50°С и в течение двух месяцев - при температурах -7 и +4 °С. При температурах +20 и +37 °С титры инфекционности препаратов снижаются с 5,75 lg ЛД_50/мл (в исходном препарате) до 4,75 и 3,0 lg ЛД_50/мл, соответственно, через один месяц хранения. За этот срок не происходит большого снижения комплементсвязывающей активности при температурах -50 и -7 °С. При остальных температурах через месяц хранения титр комплементсвязывающей активности снижается в 2,5 раза и более, и остается на этом уровне в течение двух-тpex месяцев. Полностью (до нуля) комплементсвязывающая активность препарата (исходный титр 1:20) снижается к концу третьего месяца при -50 °G, к концу второго месяца - при +37 °С. Аналогичным образом происходит и снижение преципитирующей активности вируса.

Наиболее длительно сохраняется гемагглютинирующая активность очищенного и концентрированного вируса бешенства (в течение трех месяцев), которая при дальнейшем хранении снижается.

Следовательно, культуральный вирус бешенства следует хранить не более 3-х месяцев при температуре -50 и -7⁰С. В течение этого времени практически полностью сохраняются все биологические свойства вируса бешенства. При необходимости хранения вируса свыше трех месяцев следует оставлять его при -7⁰С , так как температура хоть несколько и снижает инфекционность, но не влияет на комплементсвязывающую, гемагглютинирующую и npeципитирующую активность вируса бешенства.

Очищенные и концентрированные препараты вируса можно хранить при температурах -50, -1 и +4°С не более двух месяцев. При более длительном хранении биологическая активное вируса быстро снижается (за исключением инфекционности в случае хранения при -50 и -7 °С).

Следовательно, очищенные и концентрированные препараты вируса бешенства инактивируются в процессе хранения быстрее, чем исходный культуральный вирус.