Тема 17. Производство молекулярных и химических вакцин

 

Для создания химических вакцин необходимо знать не только локализацию и иммуногенные свойства антигенных детерминант вирусных белков, но я их первичную структуру, для чего используются приборы -секвенаторы: жидкофазные, твердофазные и газофазные. Процесс секвенирования - это специфичное расщепление белка-антигена на фрагменты и выделение их в чистом виде.

По химическому строению, основным иммунологическим свойствам, а также по методам изучения все антигенные детерминанты делят на:

1. Гаптены, искусственно присоединенные к крупным молекулам белка или полисахарида.

2. Олигосахаридные детерминанты.

3.Пептиды.

Для определения количества антигенных детерминант того или иного антигена широко используют технику моноклональных антител.

После определения первичной структуры антигенных детерминант приступают к их химическому синтезу. Затем конструируют синтетическую вакцину на основе синтезированных антигенных детерминант по строго составленному рецепту.

Получение химических вакцин методами генноинженерной технологии состоит из следующих этапов:

1. Синтез генов, комплементарных к ДНК или РНК вирусов, ко­дирующих выработку протективных антигенов.

2. Вычленение гена рестриктазами и эндонуклеазами.

3. Химикоферментный синтез искусственного гена, кодирующего протективныи антиген или ряд протективных антигенных детерминант.

4. Встройка гена в экспрессирующий про- или эукариотический вектор (плазмиды, фаги, вирусы).

5.Трансформация клеток-реципиентов и отбор клонов, продуцирующих, протективный антиген, и испытание рекомбинантных вирусов в качестве вакцины.

6. Культивирование клеток, продуцирующих протективные антигены, и конструирование вакцины.

Вся работа по производству вакцин проводится в асептических условиях, при этом ставится задача не допустить выноса используемых для производства инфекционных агентов за пределы емко, в которых проводится работа по культивированию и обработке эпизоотических штаммов возбудителей.

Контроль за качеством выпускаемых вакцин возложен на ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ВГНКИ).

 

 

Тема 18. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ-

ДИАГНОСТИКУМОВ

Приготовление вирусных диагностикумов имеет свои особенности. Диагностические антигены готовят, используя органы зараженных животных, то есть в таком случае речь идет об органных антигенах. Если такие антигены готовят с использованием культур клеток, то получают культуральные антигены. Основным их недостатком является содержание в своем составе балластных белков, в том числе белков других вирусов, которые могут быть в исходном сырье. Это влияет на специфичность и активность антигенов. Поэтому одной из сложных задач при производстве вирусных препаратов является их очистка.

Технология производства вирусных антигенов (герпеса простого и вируса болезни Ауески):

1. В роллерный матрац Винчестера с минимальной средой Игла(МСИ),содержащей 10 % триптозофосфатного бульона и 10 % сыворотки теленка, внести 2 10⁷ клеток ВНКС13 и выращивать при 37⁰ С в течение 3 сут.

2. Инфицировать культуру клеток суспензией производственного штамма вируса (20 мл в среде Игла, не содержащей сыворотки) при множественности заражения 1 БОЕ на 300 клеток.

3. Инкубировать при 37°С в течение 1 ч для адсорбции вируса клетками. Добавить 50 мл среды Игла с 5 % триптозофосфата и 5 % сыворотки теленка и инкубировать при 37°С в течение 2 дней (для вируса герпеса простого), в течение 27 - 36 ч (для вируса псевдобешенства).

4. Встряхивая сосуды, отделить клетки от стекла. Если клетки не отделяются, обработать монослойной раствором версена.

5.Осадить клетки центрифугированием при 400g в течение 10 мин.

6. Слить надосадочную фракцию и центрифугировать ее при 20000 g в течение 90 мин.

7. Полученную надосадочную фракцию слить в раствор хлорофоса, а осадок суспендировать в МСИ с 10% триптозофосфата и 5% сыворотки теленка (2 мл на бутыль).

8. Образовавшие осадок клетки разрушить в УЗД или тремя циклами замораживания и оттаивания в водяной бане.

9. Осадить обломки клеток при 400 g в течение 10 мин.

10. Надосадочную жидкость, содержащую вирус, проверить на бактериальное загрязнение, инокулируя препараты в бульон с экстрактом сердца и мозга (1 неделя при 37⁰ С) или в жидкую среду Саборада (1 неделя при 37⁰ С).

11. Вирусы очищают седиментацией в растворах с высокой плотностью, например в насыщенных растворах КВг. В этих условиях выявляются полосы, соответствующие вирионам и пустым частицам.

12. Проводят контроль качества препарата согласно нормативной документации.