Культивирование перевиваемых культур клеток

 

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Перевиваемые клетки характеризуются потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом. Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономной сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими. Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах.

 

Для выращивания клеток PLC/PRF5 добавляют питательную среду DMEM.

Для приготовления питательной среды нужно:

1. 45 мл DMEM;

2. 5 мл 10 % FBS (фетальная бычья сыворотка);

3. 500 мкл антибиотик;

4. 500 мкл глютамакс

 

С сосуда Дьюара поднимаем клетки PLC/PRF5 для пассажа. Клетки размораживают и помещают в матрас и добавляют 4 мл полной ростовой среды. Работа в ламинар боксе в обязательном порядке, заключается в асептических условиях. Приборы можно использовать только один раз. Так как может произойти контаминация клеток.

С целью подавления микрофлоры клеток в питательной среде, дополнительно могут быть включены антибиотики. Считаем количество посеянных клеток (живых - 32, мертвых - 37). Матрас с посаженными клетками ставим в термостат при +37 градусах. Матрас с посаженными клетками вводится в действие на следующий день после посадки, меняется питательная среда.

Так как в первые дни:

• возможно выделение клетками токсичных веществ;

• количество мертвых клеток на питательной среде, может увеличиться;

• может произойти контаминация клеток

 

Пассаж – перенос или пересадка клеток из одной культуральной емкости в другую. Необходимо, чтобы клетки прикрепились (осели) на дне планшета (емкости) 3-4 дня.

Пассаж PLC/PRF5 клеток карциномы печени

Опухолевые клетки перенести с маленького матраса в большой матрас.

1. Из термостата достаем опухолевые клетки

2. Пипеткой набираем питательную среду

· 1 раз промываем трипсином ЭДТА (клетки в матрасе)

· 2 раз наливаем 1 мл трипсина и ставим на 3 минуты в термостат

3. Клетки отходят от стенок матраса

4. Стерилизуем большой матрас и наливаем 30 мл питательной среды

5. Пипетируем

6. Половину питательной среды (15 мл) добавляем в большой матрас

7. Ставим в термостат (инкубатор)

 

Снятие клеток с культуральных сосудов

 

1. Слить старую среду

2. 2-3 раза промыть клетки трипсином ЭДТА

3. Залить раствором для снятия клеток

4. Инкубировать при 37°С, переодически аккуратно покачивая, обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10 минут (время зависит от клеточной линии)

5. Когда клетки полностью отделяются от субстрата, добавить полной среды или PBS и тщательно диспергировать клетки

6. Если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток, осадить центрифугированием и ресуспендировать

7. Считать и субкультивировать

 

Определение количества клеток

Количество клеток в суспензии можно посчитать в камере Горяева. Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницвемы и окрашиваются.

Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии смешивают с равным количеством раствора красителя в HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество «квадратов», в которых просчитываются клетки зависит от плотности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток).

 

Замораживание клеток

1. Только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде

2. Просчитать количество живых клеток

3. Осадить клетки (центрифугированием), удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок

4. Ресуспендировать клетки в среде для замораживания с сывороткой

5. Разлить в пробирки по 2 мл для замораживания, охладить пробирки в ледяной бане (5 минут) или в холодильнике при температуре +4 градуса.

6. Клетки замораживать медленно

7. После замерзания пробирки переносят для хранения в жидкий азот

 

 

 

Транспортировка клеток. Более предпочтительно транспортировать в сухом льду, замороженными.

Либо при комнатной температуре: клетки выращивают до 60-80% монослоя, удаляют старую среду, культуральный флакон заливают полной средой доверху и плотно закручивают крышкой. При таком способе клетки можно сохранить живыми в течение 2 суток.