Получение клеточной суспензии, ферментных препаратов бактериальных клеток

Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры микроорганизмов при 5000 g, 4^о С, в течение 30 минут. Клетки отмывали 0,1 моль/л Трис-HСl-буфером (рН = 7,5) и осаждали при тех же режимах центрифугирования в течение 20 минут. Клеточные экстракты (гомогенат) получали в результате разрушения бактериальных клеток в течение 2 минут на ледяной бане с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН - 2Т (НПП «Академприбор», Украина) при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц. Супернатант (цитоплазматическую фракцию) получали после центрифугирования гомогената при 9000 g и 4 ^оС в течение 30 минут [2, 7].

Coдержание белка oпределяли пo метoду Лoури [32]. Целые клетки предварительно подвергали щелочному гидролизу в 1 N NaOH в течение 10 минут при 90 ^оС.

 

Определение активности карбоангидраза

Активность карбоангидразы определяли по времени перехода окраски индикатора (бромтимоловый) из синей в желтую.

Реакцию проводили в маленькой пробирке, доверху заполняемой реакционной смесью следующего состава: 0,025 М Трис-HCl-буфер, pH=8,2, содержащий 1 мг/1 мл бромтимолового синего – 1,6 мл, исследуемый ферментный препарат (суспензия клеток) – 0,8 мл. Реакцию начинали добавлением 1,6 мл раствора CO₂ в воде, насыщенного при 0°, пробирку плотно закрывали резиновой пробкой, перемешивали. Всю процедуру измерения проводили при 2° (в ледяной бане). Контрольное измерение проводили с кипяченым ферментом.

Расчет активности фермента проводили по формуле: , где t_кипяч и t_свеж – время перехода окраски в присутствии кипяченого и свежего фермента. Активность карбоангидразы, определенная этим методом, выражается в условных единицах Вильбура и Андерсена [2].

 

Определение активности фермента фосфорибулокиназа

Активность фосфорибулокиназы определяли спектрофотометрически на СФ-26 (Россия) при λ =750 нм в реакционной смеси следующего состава: 0,5 М Трис-HCl-буфер, pH 7,8 -– 0,1 мл, 0,05 М MgCl₂ – 0,05 мл, вода – 0,1 мл, исследуемый ферментный препарат (суспензия клеток) – 0,05 мл, 0,05 М дитиотреит – 0,05 мл, 0,05 М рибозо-5-фосфат Na – 0,1 мл. Об активности фермента судили по скорости накопления щелочегидрализуемого фосфора рибулозо-1,5-бисфосфата.

Опыт проводили в специальных сосудиках в атмосфере инертного газа (аргон). Реакцию запускали добавлением к реакционной смеси 0,05 мл 0,05 М АТФ Na₂. Через определенные промежутки времени (0,5, 1, 2, 3, 4, 5 сек) останавливали реакцию приливанием в сосуд 0,5 мл 6%-ой трихлоруксусной кислотой.

Для определения содержания щелочегидрализуемого фосфора из надосадочной жидкости нейтрализованной NaHCO₃ (pH 8) смеси отбирали пробу 0,2 мл и добавляли 0,2 мл 2Н NaOH. Гидролиз проводили в пробирках на 10 мл при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем в каждую пробирку добавляли по 0,2 мл 2Н HCl, 0,4 мл H₂O, 1,0 мл насыщенного раствора (NH₄)₂MoO₄ в 1Н H₂SO₄, 1,0 мл 2Н HCl и 0,1 мл свежеприготовленного 1% раствора аскорбиновой кислоты. Смесь выдерживали на водяной бане в течение 5 мин при 37°, охлаждали до комнатной температуры и измеряли экстинцию при 750 нм против контроля на реактивы (полная смесь, но вместо ферментного препарата 0,1 мл 0,1 М Трис-HCl-буфера).

Количество щелочегидролизуемого фосфора, найденного по калибровочной кривой (а), соответствует 0,1 мл ферментной смеси (до остановки реакции ТХУ). Делением этого значения, на продолжительность инкубирования получали накопление продукта за 1 мин. Выбрав линейный участок кинетической кривой, определяли среднюю скорость реакции в мкг фосфора за 1 мин [2].

Расчет активности фермента проводили по формуле: .

 

Подсчет клеток

Подсчет клеток осуществлялся с помощью микроскопа CX-41 фирмы «Olympus» с фазово-контрастным устройством. Для подсчета клеток готовились препараты «раздавленная капля». Для этого на предметное стекло наносилось 2 мкл культуральной жидкости, накрывалось покровным стеклом таким образом, чтобы под ним не было пузырьков воздуха. Определение количества клеток в 1 мл культуральной жидкости осуществляли путем подсчета клеток в 20 полях зрения. Расчет количества клеток проводили по следующей формуле: , где X – количество клеток в 1мл культуральной жидкости, N – количество клеток в поле зрения, – объем микроскопируемого образца, – площадь покровного стекла (3,24*10^-4), Sп.з. – площадь поля зрения ( 3,14*10^-2), радиус поля зрения (измеряли с помощью специальной окулярной линейки), X – 5,15*10⁶N.

 

2.2.2.9. Методы определения продуктов превращения соединений серы

Раздельнoе oпределение S₂O₃^2-, S₄O₆^2-, S₃O₆^2- при иx coвмеcтнoм приcутcтвии в cреде прoвoдили метoдoм раздельнoгo иoдoметричеcкoгo титрoвания [1]. Элементную cеру внутри клетoк идентифицирoвали пo xарактернoму cветoпрелoмлению в прoxoдящем пoляризoваннoм cвете.