Тема 1. Характеристика производства основных

БИОТЕХНОЛОГИЯ

(учебное пособие часть III)

по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза,

квалификация «Бакалавр»

 

 

Казань - 2013 г.

Учебное пособие «Биотехнология» часть III написано профессорами Госмановым Р.Г. и Галиуллиным А.К. и предназначено для студентов, обучающихся по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза, квалификация «Бакалавр».

 

Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины КГАВМ им. Н.Э.Баумана от 20 ноября 2013 г., протокол № 10.

 

Рецензенты: проф. И.Н. Никитин

 

Методические рекомендации по организации самостоятельной работы студентов

Тема 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОИЗВОДСТВА ОСНОВНЫХ

ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Технологические линии, стадии и этапы производства

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, био­физических, физико-химических процессов, и состоит из большого числа разнотипного оборудования, связанного между собой материальными, энергетическими потоками и образующих технологические линии. Характер этих связей может быть весьма разнообразным: продукты и полупродукты, вырабатываемые в одних аппаратах, поступают в следующие по ходу процесса аппараты; сырье и энергия распределяются между различными потребителями.

Производство биопрепаратов осуществляется на технологических линиях производства противобактерийных, противовирусных, ди­агностических препаратов, сывороток, глобулинов, пробиотиков, антибиотиков.

Технологические процессы включают следующие операции:

1. Приготовление противобактериальных инактивированных вакцин:

- приготовление посевного материала;

- приготовление питательных сред;

- культивирование микроорганизмов;

- выделение и очистка препаратов;

- инактивация микробной массы;

- стандартизация вакцины;

- лиофильное высушивание биопрепарата;

- расфасовка (розлив) вакцины;

- укупорка и закатка флаконов (запайка ампул).-

2. Приготовление противовирусных вакцин:

- приготовление культуры клеток;

- культивирование клеток;

- культивирование вируса;

- выделение и концентрирование вируса;

- очистка вируса;

- сорбирование;

- инактивация вируса;

МУЗЕЙ КУЛЬТУР (вакцинных, производственных и др. штаммов)

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА Последовательное накопление микроорганизмов для засева культиватора

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ Подготовка компо-нентов среды, стерилизация, контроль состава

ВЫДЕЛЕНИЕ, КОНЦЕНТРИРО-ВАНИЕ И ОЧИСТКА БИОПРЕПАРАТА ИЗ КУЛЬТУРНОЙ ЖИДКОСТИ Флотация, центри-фугирование, мембранные процессы, коагуляция, адсорбция, высуши-вание, выпаривание, ионный обмен…

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ (ФЕРМЕНТАЦИЯ) с целью накопления микроорганизмов и продуктов их жизне-деятельности в искус-ственно созданных и оптимальных для выращивания условиях

КОЛЛЕКЦИЯ МИКРООРГА-НИЗМОВ

СОСТАВЛЕНИЕ СЕРИИ

РАСФАСОВКА, УПАКОВКА, МАРКИРОВКА

КОНТРОЛЬ

ОБЕЗВРЕЖИВА-НИЕ ОТХОДОВ

 

 

Типовая технологическая схема производства биопрепаратов

 

- стабилизация и стандартизация вакцины;

- лиофильное высушивание биопрепарата;

- расфасовка (розлив) вакцины;

- укупорка и закатка флаконов (запайка ампул).

К вспомогательным технологическим стадиям относятся:

- очистка и стерилизация воздуха;

- подготовка посуды и оборудования;

- очистка и стерилизация жидких продуктов;

- очистка и стерилизация продуктов производства;

- этикетировка и упаковка готовой продукции.

 

 

Тема 2. ТРЕБОВАНИЯ К ОБОРУДОАНИЮ ПРОЦЕССОВ

В БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДЫ ИХ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

Число используемых процессов микробиологического синтеза до­статочно велико. В зависимости ‘от вида процесса, применяемых сырья и культуры микроорганизмов используется различное оборудование (исходя из предъявляемых требований к аппаратуре). Так, для проведения анаэробных биотехнологических процессов (производство этанола, органических кислот, некоторых вакцин и др.) не требуется подачи воздуха в аппарат, обычно не надо интенсивно перемешивать среду, а в ряде случаев отпадает необходимость соблюдать асептические условия культивирования (культивирование дрожжей).

Для осуществления аэробных процессов производства биологически активных веществ (антибиотиков, аминокислот, ферментов, антигенов, некоторых вакцинных препаратов), напротив, необходимо обеспечить интенсивную аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, соблюдать строго асептические условия, решить сложные вопросы пеногашения и т.д. Поэтому возникает необходимость стерилизовать поступающий на биопредприятие и в аппаратуру воздух, зонировать помещения, стерилизовать приборы и аппараты.

Чтобы процесс культивирования микроорганизмов проходил про­дуктивно, необходимо соблюдать следующие правила:

1. Обеспечить подвод кислорода к клеткам и отвод образующегося диоксида углерода из культуральной жидкости (аэробы).

2.Интенсивно перемешивать культуральную жидкость для её гомогенизации, обеспечения доступа жидких и газообразных субстратов ко всем клеткам, для удаления застойных зон в среде.

3.Осуществлять стерилизацию биореактора и связанных с ним коммуникаций, обеспечить асептические условия проведения процесса культивирования.

4.Иметь системы контроля за ходом культивирования, необходимые для реализации процесса ферментации (регулярный отбор проб и определение концентрации микроорганизмов или продуктов микробного синтеза и др.).

С учётом этих требований, а также особенностей конкретных процессов разработано большое число конструкций аппаратов для культивирования.

Оборудование для микробиологической промышленности изготавливают из высоколегированных марок нержавеющей стали, что в значительной степени оправдано.

Внутренняя поверхность стенок биореактора, применяемого для глубинного культивирования микроорганизмов в стерильных условиях должна быть тщательно отполирована, желательно до зеркального блеска. Наличие грубо обработанных стенок может привести к загрязнению культуры посторонней микрофлорой, особенно в условиях непрерывного культивирования, длящегося до 30 и более суток.

Трубопроводы, подводимые к биореакторам и др. аппаратам, с которыми они технологически связаны, должны располагаться системно и обеспечивать возможность их раздельной стерилизации.

Конструктивное оформление биореактора определяется также выбранным способом отвода тепла. Известно, что в зависимости от природы микроорганизма и стадии его развития изменяется количество выделяемого тепла.

Выбор типа и конструкции биореактора зависит от пенообразующих свойств среды и способа пеногашения. Под влиянием жиров и др. химических пеногасителей значительно изменяется проницаемость цитоплазматической мембраны, ухудшается обмен веществ, что в свою очередь приводит к ингибированию биосинтеза. Естественно, поэтому стремление к полной или, если это невозможно, хотя бы частичной замене химических средств пеногашения механическими, что влечет за собой конструктивные изменения аппарата.

Применение эффективных механических средств пеногашения без добавления химических пеногасителей усложняет конструкцию аппарата, но при этом значительно снижает расход дефицитных жиров и одновременно интенсифицирует биосинтез.

Значение процесса аэрации культуральной жидкости не ограничивается лишь доставкой О₂ к клеткам. В последнее время всё большее внимание исследований уделяется вопросам десорбции газообразных продуктов метаболизма и, прежде всего, диоксида углерода. Установлено, что лимитирующим фактором при культивировании может быть не массообмен по кислороду, а недостаточная интенсивность десорбции газообразных продуктов метаболизма. В частности, предполагается наличие как минимальной, так и максимальной критических концентраций СО₂.

Процесс аэрации неизбежно сопровождается перемешиванием культуральной жидкости. Однако этот процесс неизбежно связан с механическим воздействием на клетки. Последствия этого воздействия могут быть благоприятными, если наблюдается разрушение конгломератов (гранул) клеток, и вредными, если наблюдается разрушение или повреждение клеток.

Следовательно, для каждого контрольного процесса культивирования перемешивание лимитирует процесс по одному из следующих трех направлений:

1. Массопередача газ-жидкость (создание одинаково высокой турбулентности питательной среды по всему объёму аппарата обычно не удаётся, поэтому стремятся к тому, чтобы вся жидкость прошла через зоны, где турбулентность наиболее интенсивна).

2. Массопередача жидкость-клетка (определяется перемешиванием в околоклеточной зоне и зависит от размеров клетки).

3. Механическое воздействие на клетку (зависит от срезывающих усилий, возникающих в жидкости из-за градиента скорости (сдвига). Количественно срезывающие усилия обычно характеризуются окружной скоростью лопасти мешалки).

Культуральные жидкости являются классическим примером жидкости, которая хорошо пенится.

Пенообразование при проведения аэробного процесса культивирования, безусловно, следует отнести к категории вредных явлений, осложняющих ведение процесса, поскольку:

- образование пены ведёт к уменьшению коэффициента заполнения культиватора;

- увеличиваются потери из-за уноса культуральной жидкости;

- затрудняется борьба с загрязнениями и могут выйти из строя фильтры для очистки аэрирующего воздуха;

- пенообразование ухудшает условия снабжения микроорганизмов О₂, питательными веществами и отвода продуктов метаболизма.

Для регулирования уровня пены при культивировании микроорганизмов и предотвращения её выброса из биореактора используют различные методы. Их можно разделить на пять групп.

1. Воздействие на пену химическими и физико-химическими средствами: использование питательных сред с пониженными пенообразующими свойствами; добавление ПАВ, уменьшающих прочность пленок пены.

2. Разрушение пены механическими, гидро- и аэродинамическими способами; ударное воздействие поверхностей деталей и элементов воздействие жидкости или газа; сепарирование пены инерционными, центробежными и другими методами; лёгкое изменение давления газа в пене; захват и разрушение пены потоками перемешиваемой жидкости.

3. Разрушение пены при физических воздействиях: колебания звуковой и ультразвуковой частоты; термическое пеногашение острым паром или при помощи нагретой жидкости; электрическое пеногашение.

4. Стабилизация, уровня пены путём временного уменьшения расхода аэрирующего воздуха, отключения механической мешалки, вывода избыточной пены из-аппарата.

5. Комбинированные воздействия. На практике применяются в основном химические и механические способы пеногашения, а также их сочетания.

Механические устройства для пеногашения бывают двух типов -вращающиеся и неподвижные (статические).

Действие вращающихся механических устройств для пеногашения основано на разрушении пузырьков пены при контакте с их рабочими поверхностями. Одна из простейших и наиболее характерных конструкций механического пеногасителя - гладкий диск, вращающийся с большой скоростью над поверхностью пены.

Комбинированные системы автоматического пеногашения позволяют наиболее эффективно регулировать уровень пены в ферментаторе при минимальном расходе электроэнергии и химического пеногасителя. Стабильность уровня пены обеспечивает наиболее благоприятные условия для снабжения микроорганизмов О₂ и отвода СО₂. Достижения в области развития клеточных культур, в первую очередь, связаны с созданием широкого круга культурально-тканевых противовирусных вакцин.

Новый мощный стимул культурально-тканевые методы получили в результате разработки гибридомной и ДНК-рекомбинантной технологии, с помощью которых можно получить широкий спектр биопрепаратов и удешевить производства многих традиционных биологически активных веществ.

Необходимо отметить, что аппаратурное оформление технологических стадий производства противовирусных вакцин существенно отличается от аппаратурного решения производства противобактерийных вакцин в силу своей строгой специфичности.

Развитие новых молекулярно-биологических методов и внедрение их в практику будет осуществляться на фоне успехов в разработке технологического оборудования и технических средств контроля и управления.

С помощью селекционированных, стимулированных, модифици­рованных и рекомбинантных клеточных систем осуществляется лабораторное и промышленное производство различных биопрепаратов. Особо необходимо отметить достижения в гибридомной технологии, на базе которой удалось осуществить производство широчайшего спектра лечебных и диагностических моноклональных антител.

Моноклональные антитела, находят применение для лечебных целей и используются для очистки иммуноактивных препаратов.

С использованием клеточных культур осуществляется (в том числе и промышленным способом) производство многих иммунорегуляторных факторов, лимфокинов (интерфероны, интерлейкины и другие препараты). Также налажено производство вирусных инсектицидов - препаратов, не загрязняющих биосферу, устраняющих вредных насекомых и оставляющих живыми полезных. Получаемый в культурах клеток этот вирусных продукт в настоящее время производится в относительно ограниченных масштабах.

Часть гормональных препаратов также предпочтительнее производить в культурах клеток (гормоны, имеющие 50 - 200 аминокислот).

Используемые среды для систем клеток животных могут быть сложными (60 компонентов и более). В то же время исследователи располагают пока еще недостаточной информацией о том, что и как генерирует растущая клетка, и что и как она секретирует в окружающую среду. Поэтому пока трудно сказать, какая конкретно требуется новая среда, но она должна быть дешевле существующих, проще в изготовлении и применении, содержать меньшее число компонентов, обладающих большей химической определенностью, и отличаться большей универсальностью. Здесь необходимы дальнейшие исследования. Побудительной причиной и ориентиром проведения разработок могут служить требования, предъявляемые к системам, предназначенным для производства моноклональных антител.

Существуют два основных подхода к созданию необходимого оборудования. Первый подход предполагает создание оборудования, предназначенного для ведения в оптимальных условиях только данного специфического процесса. Второй подход заключается в том, чтобы сконструировать многоцелевое оборудование, способное выполнять любой вид работы из заданной программы.

Примером первого подхода может служить создание аппаратуры для производства клеток животных, способных к генерированию целевых продуктов.

Альтернативная методология, предусматривающая иммобилизацию клеток на поверхности элементов надосадочного слоя, заключается в содержании клеток внутри пористых матриц. Такие системы были проверены в аппаратуре для производства антител из гибридомных клеток.

Разрабатывается аппаратура, позволяющая осуществлять гомогенное или квазигомогенное культивирование клеток животных (т.е. на микроносителях) в масштабах от 100 до 1000 л; с его помощью можно выращивать клетки животных (включая гибридомы) в суспензии. Незначительная модификация (ввод воздуха и установка мешалки с приводом) приводит к тому, что данное оборудование становится пригодным для производства бактерий, дрожжей и грибов. В принципе, в таком оборудовании можно производить и культуру клеток растений.

Однако во всех случаях отбор оборудования необходимо производить с учетом показателей, характеризующих его эксплуатационно-производственные качества, сопоставимые с оборудованием альтернативных систем, например: эрлифтные и башенные или колоночные биореакторы, аппараты с тяговыми трубами и др. В этом состоит суть технологической оценки конкурирующих аппаратов. Следует иметь в виду, что для большинства (если не для всех) линий клеток животных пока остаются неизвестными факторы, обуславливающие их высокую чувствительность к «срезающим усилиям», а также механизм, благодаря которому «пузырьки» интерферируют с выживаемостью и продуктивностью этих клеток. Такие вопросы лучше всего решать путем применения для культивирования клеток нестандартных сосудов и обеспечения контролируемых условий проведения процессов на основе создания непрерывно-проточных систем культивирования по схеме хемостата или турбидостата.

Как и в других областях биотехнологии, в области культивирования клеток животных и получения из них целевых продуктов невозможно увеличить размер рабочего оборудования без изменения его основных геометрических свойств и массообменных характеристик (отношение жидкости к ее объему и вводимой мощности к объему жидкости, а также коэффициента массопередачи кислорода К_L). Ощущается недостаток знаний о масштабировании таких систем культивирования клеток животных, для которых образование газовых пузырьков (и мелких пузырьков, генерирующих высокие площади контакта) является явлением нежелательным. Необходимо также иметь больше информации о факторах, ограничивающих рост клеток в циклической и непрерывной культурах.

Для оптимизации работы оборудования и процессов необходим монтаж в рабочей схеме соответствующих датчиков локальных и управляющих компьютеров, а также электронно-вычислительных машин.

За последние годы технический уровень производства биопрепаратов претерпел значительные количественные и качественные изменения. Глубинный метод культивирования становится преобладающим при изготовлении противобактерийных вакцин. Наблюдается тенденция к более широкому внедрению данного метода и в производстве противовирусных препаратов.

Основной целью оснащения биологических процессов современным оборудованием, техническими средствами механизации и автоматизации является повышение производительности и качества биопрепаратов, охрана труда и вопросы экологии.

Широкое привлечение в биотехнологии методов математического моделирования, оптимизации, масштабирования, реализации системного подхода с использованием экономико-математических методов автоматизации и методов кибернетики придало этому направлению своеобразные черты, обусловленные характером технологии, подчиненностью потребностям и специфики живых объектов и своеобразными чертами экономики биотехнологических процессов и их аппаратурного оформления.

 

МАТЕРИАЛА

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают на биопредприятие в виде чистых культур, закон­сервированными в ампулах. Каждая культура штамма имеет паспорт с описанием культурально-морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, характеристики сред и условий для их поддержания, выращивания, срока и условий хранения и транспортировки.

В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях должен быть резко сокращен или полностью прекращен клеточный обмен веществ.

На практике культуры штаммов хранят с использованием следующих основных способов:

- на скошенном агаре при температуре -1 - -5°С;

- замораживание со стабилизатором и хранение при температуре ниже

-20°С. Недопустимо многократное оттаивание и замораживание;

- лиофилизация культуры и хранение в ампулах в течение нескольких лет.

Через определенное время, оптимальное для каждого способа хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологических процессов культуру размножают в стерильных условиях.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду. Количество питательной среды в инокуляторе и биореакторе не должно превышать 70% от общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема питательной среды.

Для промышленных биореакторов обычно используют от 6 до 10% инокулянта. С плотной питательной среды выросшую культуру смывают стерильной питательной средой или физраствором и вносят в инокулятор в таком же объеме как и жидкую.

 

Тема 6. АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ

Получение высококачественных биопрепаратов в значительной степени зависит от аппаратурного оформления процессов приготовления и стерилизации питательных сред.

Для стерилизации питательных сред используют следующие методы:

- физические (термическая стерилизация, фильтрация);

- химические (щелочи, кислоты, соли металлов).

 

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Наиболее широкое применение для стерилизации питательных сред в настоящее время нашел метод термической стерилизации. Как уже отмечалось в предыдущем разделе, инактивация микроорганизмов под действием перегретого пара подчиняется уравнению кинетики первого порядка. Нагрев стерилизуемой среды осуществляется до тех пор, пока температура питательной среды станет равной температуре пара. Именно в этот момент начинается процесс стерилизации, приводящий в результате к гибели всех контаминирующих микроорганизмов.

Для стерилизации питательных сред пар используется в двух режимах: в «статических» условиях автоклава и для стерилизации с перемешиванием (с пуском пара в стерилизующую зону). Автоклавы применяются для стерилизации лабораторных биореакторов, посуды, питательных сред в относительно небольших объемах и при культивировании в монослое.

Во многих автоклавах пар производится из воды, нагреваемой электрическими тэнами. Если пар поступает от внешнего источника то необходимо, чтобы он был насыщенным. Перегретый пар по своему режиму более напоминает газ, стерилизация в этом случае напоминает стерилизацию сухим теплом.

По своим конструктивным особенностям все автоклавы могут быть поделены на четыре основные группы:

- паровые автоклавы;

- стерилизаторы оросительного типа на горячей воде;

- газовые стерилизаторы;

- комбинированные стерилизаторы.

Стерилизаторы оросительного типа на горячей воде работают по принципу прямого орошения горячей водой и ее прямого охлаждения с использованием регулируемого опорного давления. Газовые автоклавы (ЕТО-стерилизаторы) используются в тех случаях, если материал стерилизуемого продукта не выдерживает термической стерилизации.

ЕТО-газ (90% этиленооксида и 10 % СО₂ N₂), проникая в продукт, стерилизует его, не вызывая никаких структурных изменений материала.

Перспективным, с точки зрения экономики производственных плошадей и энергозатрат, является использование комбинированных стерилизаторов (автоклавов), использующих пар (формальдегид). Стерилизаторы данной конструкции используются для стерилизации паром и формальдегидом термолабильных материалов. Они обычно снабжены набором стерилизационных программ.

В настоящее время стерилизация питательных сред в основном осуществляется в реакторе-смесителе или непосредственно в биореакторе. Целью стерилизации является инактивация бактериальных спор.

Однако многие компоненты питательных сред (витамины, гормоны и т.д.) являются крайне чувствительными к длительному температурному воздействию.

Значительное повышение температуры стерилизации при сокращении времени от 24,8 мин до 0,366 сек приводит к сохранению 89 % витаминов в среде.

 

ДИАГНОСТИКУМОВ

 

Исследования сывороток больных животных на наличие в них антител, а также определение титров антител в специфических сыворотках при их промышленном изготовлении осуществляется с помощью антигенов-диагностикумов.

При изготовлении бактериальных антигенов используют или живые культуры или взвеси убитых микроорганизмов.

Приготовление диагностикумов связано, прежде всего, с тщательной подготовкой и селекцией штаммов микроорганизмов, из которых они готовятся. Производственные штаммы должны находиться в S-форме. Это обеспечивает им хорошую агглютинабельность, специфичность и образование устойчивой гомогенной взвеси.

Чаще всего для получения диагностикумов определённые штаммы микроорганизмов выращивают на агаровых средах. Культуры бактерий смывают с поверхности агара, а затем их инактивируют 0,5%-м раствором формалина (бруцелёзный, туляремийный антиген), 1%-ми растворами борной кислоты (листериозный, сальмонеллёзный, коли-антигены), нагреванием (бруцеллёзный антиген) и другими методами.

Антигены бывают корпускулярными и растворимыми.

Корпускулярные антигены представляют собой взвесь убитых (реже - живых) бактерий в физиологическом растворе с определённой концентрацией консерванта.

Во всех случаях антигены подвергают высокой степени очистки. Такие антигены используются для постановки РА, РСК, РДСК.

Примером получения корпускулярного антигена является изготовление

листериозного антигена для РСК из производственных штаммов листерий двух серогрупп (по 2 штамма на серогруппу).

Штаммы листерий выращивают на мартеновском агаре при тем-е 37 °С раздельно в течение 24 - 48 ч до получения обильного роста. Культуры выросших микроорганизмов центрифугируют в течение 20 мин при 2000 об/мин. Осадок листерий подвергают экстрагированию сначала спиртом, а затем смесью спирта и эфира. После этого опять производят осаждение биомассы листерий центрифугированием. Такую обработку антигена повторяют несколько раз. В конечном итоге листерий консервируют 1%-м раствором борной кислоты, доведя концентрацию микробной взвеси до 50 млрд/мл. Готовый антиген разливают в ампулы и подвергают контролю.

Растворимые антигены чаще всего готовят в виде экстрактов из агаровых культур микроорганизмов. Они используются для РСК при сапе, бруцеллёзе, инфекционном эпидидимите баранов и других заболеваниях, а также при постановке диагноза с применением реакции иммунодиффузии (РИД) на бруцеллёз и другие инфекции.

О-диагностикумы готовят обычно из неподвижных вариантов культур, полученных при выращивании на плотных питательных средах и обработанных спиртом или глицерином.

Сальмонеллёзные Н-диагностикумы готовят из бульонных или агаровых культур путём добавления к ним формалина, но не более 0,1 - 0,3 %-ной его концентрации. Наиболее трудно приготовить Vi-антиген, т.к. он обладает малой устойчивостью к различным воздействиям, в том числе и к формалину. Готовится он из поверхностных компонентов микробных клеток, стабилизируется 25 %-м раствором хлорида кальция и консервируется формалином.

Чтобы повысить эффективность диагностики в системе организации противоэпизоотических мероприятий, необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, пригодных к использованию в лабораторных условиях. Для этого готовят корпускулярныe антигены, окрашенные какими-либо красителями. Например, для постановки пластинчатой реакции агглютинации на бруцеллёз в настоящее время широко применяют антиген, представляющий взвесь в буферном растворе микробных клеток Br.abortus 19, инактивированных нагреванием и фенолом и окрашенных бенгальской розовой в малиново-розовый (розбенгал-проба).

При постановке диагноза на бруцеллез для кольцевой реакции с молоком используется антиген в виде взвеси инактивированных нагреванием бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет.

При диагностике пуллороза-тифа птиц при постановке кровекапельной реакции агглютинации (ККРА) на стекле используют цветной антиген, представляющий собой гомогенную взвесь микробных клеток S.gallinarum, убитых формалином и окрашенных генцианвиолетом.

Эритроцитарные диагностикумы. При некоторых инфекционных заболеваниях (бруцеллез; пуллороз, колибактериоз, пастереллез и др.) рекомендуются и производятся промышленным способом эритроцитарные диагностикумы.

Такие антигены (сальмонеллез) представляют собой 5 - 10 %-ю взвесь эритроцитов барана, сенсибилизированных полисахаридно- полипептидной фракцией соответствующих возбудителей болезни.

Они предназначены для прижизненной диагностики болезней с при­менением реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). Или (колибактериоз) - 2,5 %-ная взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигенным комплексом, полученным путем экстракции солянокислым гидроксиламином из клеток бактерий рода E.coli.

Для получения полисахаридно-полипептидной фракции проводят гидролиз бактерийной массы бактерий уксусной кислотой и осаждают ее этиловым спиртом.

Кровь для получения эритроцитов берут стерильно из яремной вены барана в сосуд со стерильным раствором Олсевере. Эритроциты несколько раз отмывают стерильным фосфатным буфером, центрифугируют, консервируют формалином и ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе. Затем их сенсибилизируют полисахаридно-полипептидной фракцией сальмонелл. Сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатным буфером с формальдегидом до 10 %-ной концентрации, расфасовывают во флаконы и сдают на контроль.

Эрйтроцитарный антиген контролируют на активность, специфичность, стерильность, концентрацию эритроцитов и рН.

 

ВАКЦИН

Инактивированные вакцины обычно содержат значительное количество посторонних вирусных белков, если в качестве активного компонента вакцины использовался цельный вирус. Концепцию биохимически чистой вакцины можно реализовать, если идентифицировать те компоненты вируса, которые стимулируют в организме реципиента образование нейтрализующих антител. Поэтому были разработаны методы получения очищенных препаратов биологически активных вирусных субъединиц, с целью усовершенствования инактивированных; противовирусных вакцин.

Существуют следующие методы фракционирования вирусных антигенов:

1. Солюбилизация:

- с помощью протеолитических ферментов - метод основан на избирательности действия протеаз и на структурных особенностях поверхностных антигенов;

- с помощью детергентов - использование ионных и неионных детергентах (додецилсульфат натрия и дезоксихолат натрия). При этом происходит практически полное разрушение вирусов. После обработки вирусов детергентами возникает смесь из 9 - 10 белков;

- с использованием органических растворителей - чаще применяют кислую экстракцию смеси хлороформа с метанолом.

2. Сепарация. Обработка вирусной суспензии соответствующим солюбилизирующим агентом приводит к разрушению вирусных частиц и выходу из них необходимых субъединиц. В результате получается смесь вирусных нуклеотидов и поверхностных субъединиц. Получить чистые субъединичные препараты можно только при разделении смеси. Одним из простейших методов отделения является адсорбирование смеси гидроокисью алюминия. Гель гидроокиси добавляется к смеси при надлежащем значении рН, полученная система подвергается центрифугированию. Надосадочную жидкость отделяют, а конгломераты гидроокиси с адсорбированными субъединицами ресуспендируют в нужном разбавителе.

В препаративном масштабе нашел применение метод использования хроматографических колонок. Но гораздо шире применяется метод выделения субъединиц с помощью центрифугирования в градиенте плотности (обычно в градиенте сахарозы). Этот метод применим как в препаративных, так и в крупномасштабных операциях.

Субъединицы, как правило, имеют меньшую плотность, чем вирусные нуклеотиды. Поэтому, когда солюбилизированная смесь центрифугируется через градиент плотности сахарозы, субъединицы и нуклеотиды будут образовывать четкие и хорошо разделяющиеся слои, которые можно собрать как самостоятельные фракции.

После выявления и выделения индивидуальных протективных антигенов возбудителя приступают к конструированию субъединичной вакцины по определенной рецептуре.

Вакцины из расщепленного вириона (сплит-вирусные вакцины) получают путем обработки эфиром цельной вирусной частицы. Такая вакцина содержит в себе осколки разрушенных вирусных частиц со всеми антигенами вируса, включая балластные примеси. Липиды при обработке вирионов этиловым эфиром в основном удаляются, что ведет к снижению пирогенных реакций и лучшей переносимости таких прививок.

Субъединичные вакцины обладают высокой иммуногенностью только при условии правильного их приготовления. Высоко очищенная субъединичная вакцина почти полностью свободна от посторонних белков клеточной или вирусной природы.

Субъединичные вакцины стандартизируют по массе белка на дозу и по специфичности иммунизирующего гликопротеида.

 

ДИАГНОСТИКУМОВ

Приготовление вирусных диагностикумов имеет свои особенности. Диагностические антигены готовят, используя органы зараженных животных, то есть в таком случае речь идет об органных антигенах. Если такие антигены готовят с использованием культур клеток, то получают культуральные антигены. Основным их недостатком является содержание в своем составе балластных белков, в том числе белков других вирусов, которые могут быть в исходном сырье. Это влияет на специфичность и активность антигенов. Поэтому одной из сложных задач при производстве вирусных препаратов является их очистка.

Технология производства вирусных антигенов (герпеса простого и вируса болезни Ауески):

1. В роллерный матрац Винчестера с минимальной средой Игла(МСИ),содержащей 10 % триптозофосфатного бульона и 10 % сыворотки теленка, внести 2 10⁷ клеток ВНКС13 и выращивать при 37⁰ С в течение 3 сут.

2. Инфицировать культуру клеток суспензией производственного штамма вируса (20 мл в среде Игла, не содержащей сыворотки) при множественности заражения 1 БОЕ на 300 клеток.

3. Инкубировать при 37°С в течение 1 ч для адсорбции вируса клетками. Добавить 50 мл среды Игла с 5 % триптозофосфата и 5 % сыворотки теленка и инкубировать при 37°С в течение 2 дней (для вируса герпеса простого), в течение 27 - 36 ч (для вируса псевдобешенства).

4. Встряхивая сосуды, отделить клетки от стекла. Если клетки не отделяются, обработать монослойной раствором версена.

5.Осадить клетки центрифугированием при 400g в течение 10 мин.

6. Слить надосадочную фракцию и центрифугировать ее при 20000 g в течение 90 мин.

7. Полученную надосадочную фракцию слить в раствор хлорофоса, а осадок суспендировать в МСИ с 10% триптозофосфата и 5% сыворотки теленка (2 мл на бутыль).

8. Образовавшие осадок клетки разрушить в УЗД или тремя циклами замораживания и оттаивания в водяной бане.

9. Осадить обломки клеток при 400 g в течение 10 мин.

10. Надосадочную жидкость, содержащую вирус, проверить на бактериальное загрязнение, инокулируя препараты в бульон с экстрактом сердца и мозга (1 неделя при 37⁰ С) или в жидкую среду Саборада (1 неделя при 37⁰ С).

11. Вирусы очищают седиментацией в растворах с высокой плотностью, например в насыщенных растворах КВг. В этих условиях выявляются полосы, соответствующие вирионам и пустым частицам.

12. Проводят контроль качества препарата согласно нормативной документации.

 

ХОЗЯЙСТВА