Белок как амфотерный коллоид. Заряд белковой молекулы.

Белки обладают свойством амфотерности, то есть в зависимости от условий проявляют как кислотные, так и осно́вные свойства. В белках присутствуют несколько типов химических группировок, способных к ионизации в водном растворе: карбоксильные остатки боковых цепей кислых аминокислот (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) и азотсодержащие группы боковых цепей основных аминокислот (в первую очередь, ε-аминогруппа лизина и амидиновый остаток CNH(NH2) аргинина).

Каждый белок характеризуется изоэлектрической точкой (pI) — кислотностью среды (pH), при которой суммарный электрический заряд молекул данного белка равен нулю и, соответственно, они не перемещаются в электрическом поле (например, при электрофорезе). В изоэлектрической точке гидратация и растворимость белка минимальны. Величина pI зависит от соотношения кислых и основных аминокислотных остатков в белке: у белков, содержащих много кислых аминокислотных остатков, изоэлектрические точки лежат в кислой области (такие белки называют кислыми), а у белков, содержащих больше основных остатков, — в щелочной (основные белки). Значение pI данного белка также может меняться в зависимости от ионной силы и типа буферного раствора, в котором он находится, так как нейтральные соли влияют на степень ионизации химических группировок белка. pI белка можно определить, например, из кривой титрования или с помощью изоэлектрофокусирования.

Амфотерность белков определяется не только присутствием свободных карбоксильных или аминогрупп в белке, но и наличием других функциональных группировок. Слабо выраженными кислотными свойствами обладают SH-группа цистеина и ОН-группа тирозина.

Электрические свойства белков определяются присутствием на их поверхности положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Наличие заряженных группировок белка определяет суммарный заряд белковой молекулы. Если в белках преобладают отрицательно заряженные аминокислоты, то его молекула в нейтральном растворе будет иметь отрицательный заряд, если преобладают положительно заряженные – молекула будет иметь положительный заряд. Суммарный заряд белковой молекулы зависит и от кислотности (рН) среды. При увеличении концентрации ионов водорода (увеличении кислотности) происходит подавление диссоциации карбоксильных групп:

и в то же время увеличивается число протонированных амино-групп;

Таким образом, при увеличении кислотности среды происходит уменьшение на поверхности молекулы белка числа отрицательно заряженных и увеличение числа положительно заряженных групп. Совсем другая картина наблюдается при снижении концентрации ионов водорода и увеличении концентрации гидроксид-ионов. Число диссоциированных карбоксильных групп возрастает

и снижается число протонированных аминогрупп

Итак, изменяя кислотность среды, можно изменить и заряд молекулы белка. При увеличении кислотности среды в молекуле белка снижается число отрицательно заряженных группировок и увеличивается число положительно заряженных, молекула постепенно теряет отрицательный и приобретает положительный заряд. При снижении кислотности раствора наблюдается противоположная картина.

7) Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда.

В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку (pI); pI является характерной константой белков. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка. В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

[H]+ + [P] x Z= [OH]-

где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы. Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

8) для белков характерна сложная структурная организация молекулы. Различают первичную,вторичную,третичную структуры. Ряд белков обладает и четвертичной структурой.

Первичная структура-это последовательность аминокислот в полипептидной цепи, связанных ковалентной кислото-амидной(пептидной связью). 20 аминокислот, формирующих первичную структуру белков, называются протеиногенными (протеин-белок). Поскольку в образовании пептидной связи участвуют только А-амино и А-карбоксильные группы аминокислот, первичная структура всегда линейна. Зная первичную структуру, местоположение каждого остатка аминокислоты, можно точно написать структурную формулу белковой молекулы, если она представлена одной полипептидной цепью. Она отвечает за последующие уровни организации белков, определяет большинство физико-химических свойств, видовую и тканевую специфичность, а также и функции белков.

9)аминокислотные остатки в пептидной цепи белков чередуются не случайным образом, а расположены в определенном порядке. линейная последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называют "первичной структурой белка".

Каждый из 50 000 индивидуальных белков организма человека имеет уникальную для данного белка первичную структуру. Все молекулы данного индивидуального белка имеют одинаковое чередование аминокислотных остатков в белке, что в первую очередь отличает данный индивидуальный белок от любого другого.

10)Именно первичная структура белковой молекулы определяет свойства молекул белка и ее пространственную конфигурацию. Замена всего лишь одной аминокислоты на другую в полипептидной цепочке приводит к изменению свойств и функций белка. Например, замена в β-субъединице гемоглобина шестой глутаминовой аминокислоты на валин приводит к тому, что молекула гемоглобина в целом не может выполнять свою основную функцию — транспорт кислорода; в таких случаях у человека развивается заболевание — серповидноклеточная анемия.

9) из известных 20 аминокислот, каждая имеет помимо аминной и карбоксильной групп свой радикал, отличающий ее от других аминокислот. В зависимости от наличия какого-либо радикала, аминокислоты образуют различные белки третичной и четвертичной структур. Образованные домены участвуют в строении четвертичных структур белка. Они связываются между собой благодаря особой последовательности радикалов, которые как бы подходят друг к другу, как "ключ к замку". Таким образом последовательность и положение радикалов обуславливают четвертичную структуру белка. Так же они способствуют образованию активного центра на глобулах, с помощью которого белки могут соединяться с лигандами органического и неорганического строения. От этого зависит их функция. Например, гемоглобин.

11) первичная структура белка представляет собой цепь последовательно расположенных аминокислотных остатков связанных между собой пептидными связями(СО-NH). Полимерные цепи обуславливают структуру и функцию белка. Замена или нехватка одной или нескольких аминокислот ведет и изменение структуры белка и его функции. В этом и заключается специфичность первичной структуры, так как она определяет строение белка. Примером образований из первичной структуры являются нуклеиновые кислоты, биополимеры, образованные остатками нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК присутствуют в клетках

12. Первичная структура белка.

 

В настоящее время расшифрована первичная структура около 2500 белков, а в природе имеется 10 в12степени разнообразных белков.

Первичная структура – это последовательность (порядок) соединения аминокислотных остатков с помощью пептидной связи.

Пептидная связь образуется за счет карбоксильной группы одной аминокислоты и аминогруппы другой аминокислоты.

В образовании первичной структуры участвуют -аминокислоты.

Пептидная связь образует остов полипептидной цепи, она является повторяющимся фрагментом:-CH-CO-NH-

Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence последовательность).

секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность а полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:
1) Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования.
2) Секвенирование каждого из полученных фрагментов.
3) Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Сначала проводят избирательный,частичный гидролиз полипептидной цепи на короткие пептиды(олигопептиды),последовательность аминокислот в которых может быть точно определена.

В частичном гидролизе выделяют 2 метода:химический и ферментативный. Химические методы основаны на применении химических реактивов,вызывающих селективный распад пептидных свячзей,образованных определенными аминокислотами,оставляя незатронутыми остальные пептидные связи.к этим избирательно гидролизующим веществам относятся бромциан(по остаткам метионина),гидроксиламин(по связям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина),N-бромсукциламид(по остаткам триптофана).обработка бромцианом предпочтительнее,т.к. метионина в составе белков содержится больше. ферментативные методы основаны на избирательном действии протеолитических ферментов,расщепляющих пептидные связи,образованные определенными аминокислотами.пепсин ускоряет гиролиз связей,образованных остатками1)фенилаланина2)тирозина3)глутаминовой кислоты.Трипсин-1)аргинина2)лизина.Химотрипсин-1)триптофана2)тирозина3)фенилаланина.

Химические методы:

Затем определяют какой перед нами олигопептид,с N-илиC-концевой аминокислотой.

Если с N-концевой,то используется либо метод Сенгера,либо метод Эдмана.

Метод Сенгера: основан на реакции арелирования полипептида1-фтор-2,4-динитробензола(ФДНБ),что приводит к образованию окрашенного в жёлтый цвет2,4-динитрофенильного производного N-концевой аминокислоты.N-аминокислоту идентифицируют хроматографией.

Метод Эмана:получил большее распространение благодаря большей чувствительности и возможности многократного применения в одной и той же пробе.фенилизотиоцианат реагирует со свободнойNH с образованием фенилтиокарбамоилпептида.затем природу аминлокислоты устанавливают хроматографически.метод эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов;реализован в специальном приборе секвенаторе.

Если с C-концевой,то используется метод Акабори.

Метод Акабори:основан на гидразинолизе полипептида.гидразин,вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида,реагирут со всеми аминокислотами за исключением С-концевой аминокислоты.образуется смесь аминоацилгидрозинов и свободной С-концевой аминокислоты.

Определяется чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. воссоздаётся первичная структура.

Современные методы определения первичной структуры белка:

рентгеноструктурный анализ,

данные о нуклеотидной последовательности кодонов РНК,позволяющие определить последовательность аминокислот в белковой молекуле.

Зная первичную структуру,можно написать стуктурную формулу белковой молекулы,а начит снтезировать этот белок искусственным путём и знать его свойства.

13. Вторичная структура белка -конфигурация полипептидной цепи,т.е.способ свёртывания,скручиванияполипептидной цепи в спиральную или какую-либо другую конформацию.процесс этот протекает не хаотично,а в соответствии с программой заложенной в первичной структуре.

Варианты вторичной структуры:-спираль и.наиболее вероятным типом строения принято считать.закручивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке(правый ход спирали),что обусловлено L- аминокислотным составом природных белков.движущей силой в возникновении является способность аминокислот к образованию водородных связей. стабильность вторичной структуры обеспечивается в основном водородными связями.водородные связи являются нековалентными и отличаются малой прочностью,но т.к.в белковой молекуле число водородных связей очень велико,они в сумме обеспечивают скручивание полипептидной цепи в спиральную структуру,сообщая ей компактность и жёсткость.

В на каждый виток приходится 3,6 аминокислотных остатка.шаг спирали 0,54 нм на виток,а на один аминокислый остаток приходится 0,15 нм.угол подъёма спирали 26; через 5 витков спирали (18 аминокислотных остатков) структурная конфигурация полипептидной цепи повторяется,значит период повторяемости -другои тип конфигурации цепей.встречается в белках волос,шёлка,мышц и других фибриллярных белках.две илиболее линейные полипептидные цепи,расположенные параллельно,прочно связываются водородными связями,образуя структуру типа складчатого слоя.

14. третичная структура белка -трёхмерная пространственная структура, образующаяся за счет взаимодействия между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи. Различают две основные формы конформаций: Т-форму (от англ. tensed – напряженная) и R-форму (от англ. relaxed – расслабленная). Между этими формами осуществляются переходы, соответственно отражающиеся в биологических свойствах.

В соответствии с формой белковой молекулы, обусловленной третичной структурой, выделяют следующие группы белков:

1) Глобулярные белки. Пространственная структура этих белков в грубом приближении может быть представлена в виде шара или не слишком вытянутого эллипсоида - глобулы. Как правило, значительная часть полипептидной цепи таких белков формирует -спирали и -складки. Соотношение между ними может быть самым различным. Например, у миоглобина имеется 5 -спиральных сегментов и нет ни одной -складки. У иммуноглобулинов, наоборот, основными элементами вторичной структуры являются -складки, а -спирали вообще отсутствуют. В вышеприведенной структуре фосфоглицераткиназы и те и другие типы структур представлены примерно одинаково. В некоторых случаях, как это видно на примере фосфоглицераткиназы, отчетливо просматриваются две или более четко разделенные в пространстве (но тем не менее, конечно, связанные пептидными мостиками) части - домены. Зачастую различные функциональные зоны белка разнесены по разным доменам.

2) Фибриллярные белки. Эти белки имеют вытянутую нитевидную форму, они выполняют в организме структурную функцию. В первичной структуре они имеют повторяющиеся участки и формируют достаточно однотипную для всей полипептидной цепи вторичную структуру. Так, белок -креатин (основной белковый компонент ногтей, волос, кожи) построен из протяженных -спиралей. Фиброин шелка состоит из периодически повторяющихся фрагментов Gly - Ala - Gly - Ser, образующими -складки. Существуют менее распространенные элементы вторичной структуры, пример - полипептидные цепи коллагена, образующие левые спирали с параметрами, резко отличающимися от параметров -спиралей.

15. связи,участвующие в формировании третичной структуры белка:

гидрофобные взаимодействия и силы ванн дер Ваальса между близко прилегающими друг к другу атомами. в результате белковой глобулы формируется гидрофобное ядро.

Ионные связи возникают между заряженными(анионными)карбоксильными группами радикалов и положительно заряженными (катионными)группами радикалов.

Водородные связи возникают между гидрофильными незаряженными группами (-ОН,,SH-группы) и любыми другими гидрофильными группами.

ковалентные связи: к ним относятся дисульфидные связи,образовавшиеся за счет взаимодействия SH-групп двух остатков цистеина.большинство внутриклеточных белков лишены дисульфидных связей,но такие связи характерны для белков,секретируемых клеткой во внеклеточное пространство.к таким белкам относятся гормон инсулин и иммуноглобулин.

трехмерная структура белковой молекулы также содержит информацию, но уже совершенно нового типа, а именно функциональную, которую акад. В.А. Энгельгардт назвал интрамолекулярной информацией. Как будет показано далее, все биологические свойства белков (каталитические, гормональные, антигенные и др.) связаны с сохранностью их третичной структуры, которую принято называть нативной конформацией. Любые воздействия (термические, физические, химические), приводящие к нарушению этой конформацииHYPERLINK "http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2111.html" молекулы (разрыв водородных и других нековалентных связей), сопровождаются частичной или полной потерей белком его биологических свойств.

16.фолдинг белков- процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру.для многих белков,имеющих высокую молекулярную массу и сложную пространственную структуру,фолдинг протекаетпри участии специальной группы белков,которые называют шапероны(няни).на вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов,ещё не спрятанных внутрь молекулы,и поэтому эти пептиды склонны к агрегации.белки-шапероны на время формирования нативной конформации белка отделяют реакционно-способные аминокислотные остатки от таких же остатков других аминокислот,дабы не произошла агрегация.

Шаперо́ны (англ. chaperones) — класс белков, главная функция которых состоит в восстановлении правильной третичной структуры повреждённых белков, а также образование и диссоциация белковых комплексов. Термин «молекулярный шаперон» впервые был использован в работе Ласкей и других при описании ядерного белка нуклеоплазмина, способного предотвращать агрегирование белков- гистонов с ДНК при образовании нуклеосом. Шапероны есть во всех живых организмах, и механизм их действия, нековалентное присоединение к белкам и их «расплетение» с использованием энергии гидролизаАТФ также консервативен.

Многие шапероны являются белками теплового шока, то есть белками, экспрессия которых начинается в ответ на рост температуры или другие клеточные стрессы. Тепло сильно влияет на фолдинг белка, а некоторые шапероны участвуют в исправлении потенциального вреда, который возникает из-за неправильного сворачивания белков.

Другие шапероны участвуют в фолдинге только что созданных белков в тот момент, когда они «вытягиваются» из рибосомы. И хотя большинство только что синтезированных белков могут сворачиваться и при отсутствии шаперонов, некоторому меньшинству обязательно требуется их присутствие.

Другие типы шаперонов участвуют в транспортировке веществ сквозь мембраны, например в митохондриях и эндоплазматическомHYPERLINK "http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BD%D0%B4%D0%BE%D0%BF%D0%BB%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%B0%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%80%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%83%D0%BC" HYPERLINK "http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BD%D0%B4%D0%BE%D0%BF%D0%BB%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%B0%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%80%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%83%D0%BC"ретикулуме у эукариот.

Продолжают обнаруживаться новые функции шаперонов, например, участие в разрушении белка, деятельности бактериального адгезина и в реакциях на заболевания, связанные с агрегацией белков.