Свойства и методы изучения белков

В зависимости от состава аминокислотных группировок белковые молекулы, находясь в растворенном состоянии, могут вступать в различ-ные химические реакции, с помощью которых можно проводить качес-твенные тесты на наличие тех или иных группировок в молекуле белка, а также проводить качественные реакции для обнаружения белков. Так, например, при взаимодействии белков с крепкой азотной кислотой обра-зуется жёлтое окрашивание, которое свидетельствует о наличии радика-лов ароматических аминокислот. Такая качественная реакция на белки получила название ксантопротеиновой реакции.

При добавлении к щелочному раствору белка небольшого коли-чества медного купороса происходит образование комплексного соединения катионов меди (Cu²⁺) с пептидными группировками белка, окрашивающего раствор в сине-фиолетовый цвет. Эту реакцию называют биуретовой, так как такое же окрашивание с катионами меди дает биурет, имеющий группировку -CО-NН-.

В молекулах белков в составе аминокислотных радикалов имеются аминные и карбоксильные группы, которые, как и в аминокислотах, в зависимости от реакции среды могут образовывать анионы или катионы, способные в электрическом поле двигаться соответственно к аноду или катоду. При определенном значении pH, индивидуальном для каждого типа белков, устанавливается равенство положительных и отрицательных зарядов и суммарный заряд молекулы становится равным нулю. Такое состояние белковой молекулы называют изоэлектрическойточкой.

При pH физиологической среды ниже pH изоэлектрической точки белка белковая молекула заряжена положительно за счет заряда аминных групп, присоединяющих катионы водорода. Если же pH среды выше pH изоэлектрической точки белка, белковая молекула заряжена отрицательно вследствие диссоциации карбоксильных групп. И в том, и в другом случае все молекулы данного белка имеют одинаковый по величине заряд, кото-рый обусловливает взаимное отталкивание молекул, вслебствие чего они легче удерживаются в растворе.

В изоэлектрической точке между молекулами белка нет электрос-татического отталкивания и они легко переходят в осадок. Вследствие того, что белки в изоэлектрической точке имеют минимальную растворимость, для их выделения применяется специальный прием, называемый изоэлектрическим осаждением.

Значение pH изоэлектрической точки белков зависит от их ами-нокислотного состава, определяющего число свободных аминных и карбоксильных групп в молекуле. При увеличении в белке содержания остатков дикарбоновых кислот pH изоэлектрической точки смещается в кислую сторону, а при возрастании количества остатков диамино-монокарбоновых кислот - в щелочную сторону.

Растворимость белков зависит от степени гидратации белковой молекулы, которая определяется наличием на её поверхности гидро-фильных группировок, способных образовывать с молекулами воды водо-родные связи или вступать в электростатические взаимодействия. В результате таких взаимодействий вокруг белковой молекулы формируется гидратная оболочка, включающая несколько слоев молекул воды и удер-живающая белковую молекулу в растворенном состоянии. Если под воз-действием каких-либо факторов убрать гидратную оболочку вокруг бел-ковых молекул, то они вступают в межмолекулярные взаимодействия между собой, образуя более крупные агрегаты, способные осаждаться из раствора.

При насыщении белкового раствора некоторыми органическими растворителями (спирт, ацетон) или солями, которые сильнее связывают молекулы воды, чем белки, происходит обезвоживание белковых молекул, вследствие чего они в результате агрегации образуют более крупные частицы и выпадают в осадок. Для предотвращения денатурации осаждение белков органическими растворителями проводится при пониженной температуре (-5˚C). Выделенные таким способом белки после удаления органического растворителя снова можно растворить в воде или слабом рстворе соли, при этом белки сохраняют свои нативные свойства.

Процесс осаждения белков в насыщенных растворах нейтральных солей называют высаливанием. Высаливание белков очень часто приме-няется для выделения и очистки ферментов и других белковых препа-ратов.

Сухие препараты белков или сухая растительная масса, содержащая белки, способны впитывать воду, при этом происходит увеличение объема и может создаваться очень сильное давление. Такие свойства белков назы-вают набуханием. Процессы набухания белков играют важную роль при прорастании семян и учитываются при разработке технологий хранения и переработки растительной продукции (набухание белков при созревании теста, приготовлении кондитерских изделий; набухание зерна при его замачивании и др.).

Белковые молекулы вследствие крупных размеров не способны диффундировать через биологические мембраны, которые свободно про-ницаемы для молекул воды и низкомолекулярных незаряженных веществ. Благодаря этому свойству белков возможна локализация ферментов и катализируемых ими реакций в замкнутых межмембранных отсеках растительной клетки - компартментах.

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Огромное разнообразие белков по составу и строению молекул, физико-химическим свойствам и выполняемым функциям не позволяет создать единой классификации белковых веществ. По составу молекул белки подразделяют на два больших класса - протеины и протеиды. Протеины - это типичные полипептиды, образованные только из аминокислот. Протеиды имеют в своем составе полипептидные группировки, с которыми прочно связаны другие соединения неаминокислотной (небелковой) природы.

ПРОТЕИНЫ. Молекулы протеинов заметно различаются по физико- химическим свойствам и это положено в основу их классификации по группам растворимости или выполняемым функциям.

Растворимые в воде протеины называют альбуминами. Типичными представителями альбуминов являются белок куриного яйца - овальбумин, водорастворимые белки зерна пшеницы, ржи, ячменя - лейкозины, легуме-лин из зерна гороха и других зернобобовых культур.

Альбумины содержатся во всех тканях растений и обладают высокой биологической активностью, так как к ним относятся многие белки-фер-менты, белковые ингибиторы ферментов, белки-антивитамины, многие регуляторные белки.

Белки, растворимые в растворах нейтральных солей, называют гло-булинами. Чаще всего для извлечения глобулинов используют 5-10% рас-творы NaCl или KCl.

Глобулины содержатся во всех клетках и тканях живых организмов и выполняют жизненно важные функции. К глобулинам относятся многие ферментные и регуляторные белки, а также запасные белки семян и других органов растений. Многие растительные глобулины выделены в кристаллическом виде и хорошо изучены. Так, из семян сои выделен гли-цинин, из фасоли - фазеолин, из гороха - легумин, из конопли - эдестин, из люпина - конглютин, из картофеля - туберин.

В семенах злаковых растений накапливается очень много запасных белков, растворяющихся в 70% водном растворе этанола, их называют проламинами. Синтез в семенах проламинов - генетическая особенность злаковых растений, тогда как в других растениях эти белки не образуются. Они также не синтезируются в вегетативных органах растений (в том числе и злаковых). Название проламины этой группе белков было дано вследствие того, что при их гидролизе образуется много аминокислоты пролина и аммиачного азота.

Проламины - основные белки клейковины пшеницы и других злако-вых растений. Проламин пшеницы называют глиадином, проламин кукуру-зы - зеином, проламин овса - авенином, проламин ячменя - гордеином, про-ламин ржи - секалином.

Белки, не растворимые в воде, водных растворах солей и спирта, но хорошо растворяющиеся в щелочных растворах (0,1-0,2% раствор NaOH), называют глютелинами. Они содержатся в любых растительных клетках, но особенно их много в семенах злаковых растений. Глютелины входят в состав клейковины. В семенах эти белки выполняют роль запасных веществ, а в листьях глютелины по-видимому являются структурными белками. Наиболее хорошо изучены глютелины пшеницы - глютенины и глютелины риса - оризенины.

Альбумины, глобулины, проламины и глютелины растений состоят из большого набора индивидуальных белков. Методом электрофореза каждая из этих групп белков может быть разделена на 20-30 компонентов, различающихся по электрофоретической подвижности, а методом изо-электрофокусирования - на несколько десятков белковых компонентов.

В хромосомах клеточных ядер содержатся водорастворимые белки - гистоны, играющие важную роль в образовании структуры хроматина, так как связаны с ДНК. Они имеют высокую концентрацию основных ами-нокислот - лизина и аргинина (25-30%), поэтому относятся к щелочным белкам, у которых очень сильно выражены свойства оснований. Основная функция гистонов - упаковка молекул ДНК в ядрах клеток высших организмов. Гистоны H2a, H2б, H3 и H4, взаимодействуя с ДНК, образуют упорядоченные ядерные структуры - нуклеосомы, связь между которыми обеспечивают гистоны H1. Гистоны, богатые аргинином (H3 и H4), у разных организмов очень мало отличаются по их аминокислотным последовательностям, а богатый лизином гистон H1 по составу аминокислот проявляет довольно высокую видовую специфичность.

К протеинам также относятся склеропротеины, представляющие бел-ки, которые нерастворимы в воде и большинстве других растворителей. Они выполняют структурную функцию, образуя длинные параллельные полипептидные цепи, соединенные поперечными связями в прочные структуры. К этой группе белков относятся коллаген сухожилий, миозин мышц, кератин волос, эластин кровеносных сосудов, фиброин шелка.

ПРОТЕИДЫ. В зависимости от химической природы небелковой части протеиды разделяют на несколько групп: гликопротеиды, хромопротеиды, липопротеиды, флавопротеиды, металлопротеиды, нуклеопротеиды и др.

Гликопротеиды. В составе молекул гликопротеидов к белку через аминокислотные остатки присоединены моносахариды или их производные - манноза, галактоза, глюкозамин, глюкуроновая кислота и др. К гли-копротеидам относятся многие ферменты, мембранные белки, защитные белки иммуноглобины и лектины, некоторые запасные белки (вицилин семян фасоли), белок внеклеточного матрикса - ламинин, некоторые ядовитые белки (рицин клещевины).

Липопротеиды. Они образуются при соединении белков с липидами и являются основными компонентами цитоплазматических, хлоропластных и митохондриальных мембран. При образовании мембранных липопротеидов к C или N-концам полипептидных цепей белка присоединяется гликолипидная или липидная группировка, которая делает эту часть мо-лекулы белка гидрофобной и поэтому способной к взаимодействию с липидными компонентами мембраны. Липидная часть липопротеида обычно представлена фосфатидилинозитом и диацилглицерином.

Нуклеопротеиды. Соединения белков с нуклеиновыми кислотами, играют важную роль в процессах жизнедеятельности организмов, связанных с передачей наследственной информации. Они являются главным веществом хромосом, рибосом и пластидных факторов наслед-ственности.

Фосфопротеиды. Это белки, в которых к остаткам серина, треонина, тирозина, имеющим HO-группы, сложноэфирной связью присоединяются остатки ортофосфорной кислоты. Фосфорилирование белков играет важную роль в регулировании активности ряда ферментов: гликогенфосфорилаз (катализирующих фосфоролиз гликогена), гликогенсинтетаз (катализирую-щих синтез гликогена), синтетаз жирных кислот, пируватдегидрогеназы, многих ферментов, образующих систему клеточного деления. Фосфорили-рованию могут подвергаться также и другие белки – регуляторные, защитные, транспортные, запасные.

Металлопротеиды. Имеют в своем составе группировки, содержа-щие атомы металлов. К ним относятся белки, обладающие каталитичес-кими свойствами: цитохромы, пероксидаза, каталаза, глобины (осу-ществляющие связывание и перенос кислоода), в состав которых входит железо; аскорбинатоксидаза, фенолоксидазы, тирозиноксидаза, пластоцианин, содержащие медь; нитратредуктаза, содержащая молибден; нитрогеназа, содержащая молибден и железо; многие другие ферменты.

Известны белки-ферменты, имеющие в своем составе производные витаминов и нуклеотидные группировки, в связи с чем такие белки можно назвать витаминопротеидами и нуклеотидопротеидами. Более подробно они будут рассмотрены в главе "Ферменты".