Протозойні хвороби 4. 1. Методи діагностики протозойних хвороб

Зажиттєва діагностика протозойних хвороб. Залежно від виду та локалізації збудника діагностику протозойних хвороб проводять мікроско­пічними й серологічними методами.

Мікроскопічні методи досліджень. Для виявлення збудників бабезі­озу, анаплазмозу, які локалізуються в еритроцитах, бореліозу птиці, збудник якого паразитує в плазмі крові, роблять тонкий мазок. Одноклітинні орга­нізми, які паразитують у травному каналі (кокцидії, балантидії), виявляють флотаційними методами (Фюллеборна, Дарлінга) або методом нативного мазка. У разі підозри щодо трихомонозу досліджують слиз із статевих орга­нів методом роздавленої краплі.

Виготовлення високоякісного мазка крові має велике значення для до­стовірної діагностики кровопаразитарних хвороб. Техніка виготовлення маз­ків полягає у підготовці предметних стекол, виготовленні мазків крові, їх фіксації та фарбуванні.

Підготовка предметних стекол. Для виготовлення доброякісного тонко­го мазка потрібно мати чисті, знежирені, без слідів кислот і лугів предметні стекла. Для цього їх миють у теплій воді з мийним засобом (мило, пральний порошок), споліскують і кип'ятять у 2%-му розчині соди впродовж 2 — 3 год. Після цього промивають у проточній воді 12 год, споліскують дистильованою водою, витирають насухо рушником і вміщують для знежирення у банку з притертою кришкою у суміш Никифорова (спирт етиловий 96%-й і ефір для наркозу в однакових кількостях) на термін не менш як 24 год. Перед засто­суванням стекла виймають із банки пінцетом і витирають чистою тканиною, що не залишає ворсинок, утримуючи їх за ребра.

Виготовлення мазків крові. Кров у тварин беруть із периферичних судин вушної раковини або кінчика хвоста, а у птиці — з гребеня чи сережок. Щоб виготовити мазок, потрібно мати шліфоване предметне скло зі зрізаними кутами. Край його має бути ідеально рівним. Кути зрізають для того, щоб мазок крові був вужчим за предметне скло, на якому він зроблений.

Місце взяття крові вистригають, протирають 70%-м етиловим спиртом або спирт-ефіром. Прокол роблять стерильною голкою чи надрізають ножи­цями кінчик вуха. Використовують першу краплю крові завбільшки з про­сяне зерно, яку наносять на кінець знежиреного предметного скла. Якщо крапля велика, мазок виходить товстим, нерівним і зміщується за край скла.

Предметне скло з краплею крові беруть у ліву руку між великим і серед­нім пальцями. Кінчиками великого і вказівного пальців правої руки захоп­люють ребра шліфованого предметного скла, ставлять його спереду краплі крові під кутом 45° і рухають управо до зіткнення з нею. При цьому крапля рівномірно розтікається по його ребру. Потім швидко і легко, без натискання проводять ребром шліфованого скла справа наліво по предметному, рівно­мірно розподіляючи по ньому кров. Мазок має закінчуватись нерівно, так званою «мітелкою».

У теплу пору року мазки швидко висихають на повітрі. В холодну погоду їх сушать на грілці чи стерилізаторі, заповнених теплою водою. Під час ви­сушування мазки слід оберігати від мух та прямих сонячних променів. Піс­ля висушування їх підписують простим олівцем чи голкою по товстому краю, вказуючи вид тварини, її кличку, дату виготовлення мазка.

Мазки фіксують в одному з таких фіксаторів: у метиловому спирті — 3 — 5 хв, у суміші Никифорова — 15 — 20 хв, в етиловому спирті — 20 хв. Зафік­совані мазки виймають із фіксатора пінцетом і вертикально вміщують у штатив для предметних стекол для висихання. Зафіксовані й висушені маз­ки фарбують.

Фарбування мазків за методом Романовського. Розчин фарби Романов- ського, що є в продажу, — концентрований. Для отримання робочого розчи­ну його розчиняють дистильованою водою. Оптимальне розчинення фарби і тривалість фарбування мазків установлюють дослідним шляхом. Для цього в трьох посудинах готують різне розчинення фарби: в першій — 1 крапля концентрованої фарби на 1 мл води; у другій — 2, у третій — 3 краплі. Кож­ним із розчинів фарбують 5 — 6 зафіксованих мазків крові впродовж різного часу — 20, 25, 30, 35, 40 хв. Після цього мазки досліджують і визначають розчинення фарби й тривалість, за яких отримано найкраще фарбування. Цей процес називають титруванням фарби і визначенням експозиції.

Для фарбування мазків завжди використовують свіжоприготовлений робочий розчин фарби із розрахунку 3 - 4 мл на один препарат. Його кра­ще підшаровувати під скло з мазком. При цьому на поверхні мазка не за­лишається мікрочасточок нерозчиненої фарби, що полегшує мікроскопію. Після фарбування препарати промивають проточною водою, висушують на повітрі й досліджують за допомогою імерсійної системи мікроскопа. Прави­льно пофарбовані мазки мають рожевий колір з фіолетовим відтінком. Еритроцити забарвлюються у рожевий колір, цитоплазма лімфоцитів — у синій, а їхні ядра — у темно-фіолетовий. Цитоплазма одноклітинних орга­нізмів набуває блакитного, а їхні ядра — темно-червоного або червоного кольору.

Фарбування мазків за методом Паппенгейма. Для цього застосовують два барвники: фарбу Май-Грюнвальда і Романовського. При фарбуванні цим методом мазки не фіксують, оскільки фарба Май-Грюнвальда готується на метиловому спирті і є барвником-фіксатором.

На нефіксовані мазки наносять 2 — 3 мл фарби Май-Грюнвальда на 3 хв. Після цього фарбу змивають водою, препарати заливають свіжоприготовле- ним робочим розчином фарби Романовського на 15 — 20 хв. Мазки промива­ють водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

Серологічна діагностика дає змогу встановити діагноз не лише у тва­рин з вираженими ознаками хвороби, а й у паразитоносіїв. У лабораторіях для діагностики протозойних хвороб застосовують РЗК, РТЗК, РІФ, ЕЬІ8А. Антигени, виготовлені зі збудників, чітко специфічні, допомагають точно встановити діагноз.

Посмертна діагностика протозойних хвороб. Патологоанатомічні зміни при більшості протозойних хвороб досить специфічні. Так, при бабе­зіозі трупи часто виснажені, слизові й серозні оболонки та підшкірна кліт­ковина жовтяничні або анемічні, лімфовузли збільшені. Селезінка різко збільшена. Сеча часто забарвлена у червоний колір. Однак вирішальне значення у встановленні діагнозу має виявлення збудника в трупі. Для цього в разі підозри щодо бабезіозу роблять мазки-відбитки із селезінки, печінки, лімфовузлів, які фіксують і забарвлюють за методом Романов- ського.

При підозрі щодо кокцидіозів основні зміни спостерігаються у кишках, слизова оболонка яких катарально-геморагічно запалена, потовщена, з кро­вовиливами. Для підтвердження діагнозу за допомогою скальпеля або предметного скла беруть зскрібок зі слизової оболонки, кладуть на предмет­не скло, накривають накривним скельцем і досліджують без фарбування під мікроскопом з метою виявлення ооцист.

Слід мати на увазі, що в трупах найпростіші зберігаються недовго і впро­довж 20 — 30 год руйнуються. Тому лабораторні дослідження потрібно про­водити впродовж першої доби після смерті тварини.