Тема 4. Активная защитная реакция растений

Активная защитная реакция растений. Продуцирование видов реактивного кислорода и оксида азота (окислительная вспышка). Укрепление клеточных стенок. Перепрограммирование транскрипции и синтез PR белков и других связанных с защитой белков. Синтез фитоалексинов. Синтез салициловой и жасмоновой кислот. Глушение генов как реакция устойчивости к вирусам. Реакция сверхчувствительности как форма апоптоза. Развитие системной приобретенной устойчивости.

Типы активируемых защитных откликов растений.

 

 

(A) Сверхчувствительный отклик отдельных клеток мезофилла салата-латука, в которые проникла гаустория несовместимого изолята биотрофного гриба Bremia lactucae. R ген салата-латука Dm? (Bennett et al., 1996).

(B) Генерация H₂O₂ в клеточных стенках салата-латука, в близости от несовместимых бактерий P. syringae pv phaseolicola. H₂O₂ была определена в клеточных стенках (CW) через 5 часов после инокуляции бактериями (b) как черные отложения в просвечивающем электронном микроскопе посредством окрашивания хлоридом цезия (J. Mansfield, неопубликованные данные).

(C) Образование папилл. Папилла развивается под проникающей гифой (PP) и прорастающей спорой (S) авирулентного изолята биотрофного гриба Erysiphe graminis f sp hordei на листьях ячменя, эксперссирующего ген Mlg.

(D) Обогащенные гидроксипролином гликопротеины (HRGP) накапливаются в черешках турнепса (Brassicae campestris) в ответ на заражение авирулентным изолятом Xanthomonas campestris. Совместимое взаимодействие показано на вставке. HRGP были выявлены отпечатыванием ткани на нитроцеллюлозе и использованием моноклонального антитела JIM 11, выработанного против HRGP и затем сделанного видимым посредством ферментативной активности щелочной фосфатазы (Smallwood et al., 1994; Davies, 1996).

(E) Отложение каллозы в клетках мезофилла листьев Arabidopsis в сайтах несовместимого заражения изолятом Peronospora parasitica Noco2 у экотипа Ws, экспрессирующего R ген Rpp14. Каллоза была выявлена окрашиванием анилиновым голубым и флуоресценцией в УФ свете (Parker et al., 1993).

(F) Образование повреждений ВТМ в листьях табака. Значительное увеличение размножения ВТМ в листьях табака проявляется как расширение опосредованных геном N локальных поражений, обусловленное непрерывным удалением индуцированной SA. Это было достигнуто посредством конститутивной экспрессии гена nahG P. putida, кодирующего фермент салицилатгидроксилазу {salicylate hydroxylase} (Gaffney et al., 1993; Delaney et al., 1994). Локальные повреждения дикого типа при таком же увеличении показаны на вставке.

(G) Лигнификация и инициация деления клеток в стеблях Brassica napus в ответ на низкоагрессивный изолят Leptosphaeria maculans. Полимеры лигнина были выявлены посредством автофлюоресценции и их присутствие подтверждено окрашиванием с использованием флороглюцингидлохлорида (Hammond and Lewis, 1987).

(H) Образование сосудистого геля или тилозы в сосудах ксилемы (V) устойчивого генотипа какао (Theobroma cacao) в ответ на колонизирующий сосуды гриб Verticillium dahlia. Микроанализ с помощью рентгеновских лучей сканирующего электронного изображения внутри сосудистого геля (VG) или смежных паренхимных клеток ксилемы (XP) выявил присутствие неорганической серы, как показано на вставке (Cooper et al., 1996).

(I) Индукция промотора репортерного гена β-1,3-глюкуронидазы (GUS) в генном слиянии в Cf-5- экспрессирующем томате в сайте проникновения в лист авирулентного изолята гриба Cladosporium fulvum. Верхняя фотография, 3 дня после заражения; нижняя фотография, 8 дней после заражения. Стрелки указывают на раздутую клетку мезофилла в основании подустьичной полости, в которую произошло проникновение (Ashfield et al., 1994).

Продуцирование видов реактивного кислорода и оксида азота (окислительная вспышка)

Продуцирование видов реактивного кислорода, вероятно, играет ключевую роль в защите растений. Часто это является первым откликом, активируемым при многих несовместимых взаимодействиях. Doke и соавторы (1983, 1988) были первыми, кто сообщил, что супероксидные анионы (O₂^{∙ ─}) продуцируются при несовместимых взаимодействиях, первоначально между картофелем и Phytophthora infestas, а затем между табаком и вирусом табачной мозаики. Генерируемый O₂^{∙ ─} быстро дисмутирует либо неферментативно, либо через катализируемую супероксиддисмутазой реакцию до перекиси водорода HO₂^∙ + O₂^{∙ ─} + Н⁺ ↔ Н₂О₂ + О₂ либо 2O₂^{∙ ─} + 2Н⁺ ↔ Н₂О₂ + О₂, и таким образом у большинства растительных систем обнаруживается накопление H₂О₂. При кислом рН, таком, который наблюдается в клеточной стенке растения, период полужизни супероксида составляет <1 секунды. Поскольку H₂О₂ не имеет неспаренного электрона, она может пересекать биологические мембраны, что заряженные виды O₂^{∙ ─} могут делать очень медленно. Как O₂^{∙ ─}, так и H₂О₂ имеют промежуточную степень реакционной способности, и клеточные повреждения, вызываемые реактивными видами кислорода (ROS) по-видимому обусловлены их превращением в более реактивные виды. Протонирование O₂^{∙ ─}, которое происходит более легко при низком рН, дает гидропероксильный радикал HO₂^∙. Поскольку HO₂^∙ является менее полярным, чем O₂^{∙ ─}, он может пересекать биологические мембраны примерно так же эффективно, как и H₂О₂. В отличие от O₂, HO₂^∙ может непосредственно атаковать жирные кислоты, и, как показано, превращает линоленовую, линолевую и арахидоновую кислоты в перекиси липидов. Таким образом, при подходящих условиях, генерация O₂^{∙ ─}, приводящая к образованию HO₂^∙, может приводить к повреждению мембран и образованию массива потенциальных сигнальных молекул перекисей липидов.

В присутствии Fe²⁺, H₂О₂ может претерпевать реакцию Фентона {Fenton reaction}, которая приводит к появлению крайне деструктивного гидроксильного свободного радикала OH∙:

Fe³⁺ + O₂^{∙ ─} → Fe²⁺ + O₂ ; Fe²⁺ + H₂О₂ → OH∙ + OH^– + O₂

который может инициировать самопроизвольное перекисное окисление липидов. Если H₂О₂, входящая в цитоплазму клетки, сохраняется в достаточно высокой концентрации, чтобы достичь ядра растения или патогена, она может реагировать с внутриклеточными ионами металлов, образуя OH∙, который, как известно, фрагментирует ДНК сайт-специфической атакой. Таким образом, продуцирование ROS может приводить к значительному повреждению как хозяина, так и патогена и заставляет растительные клетки активировать массивы защитных механизмов.

В относительно недавних исследованиях с использованием культуры клеток растений было показано, что растения, вероятно, имеют механизм продуцирования O₂^{∙ ─}, в котором принимает участие NADPH-оксидаза, аналогичная той, которую используют нейтрофилы млекопитающих.

Однако клетки растений имеют еще два других пути генерации ROS. Во-первых, это белок оксалатоксидаза, которая может продуцировать H₂О₂ из щавелевой кислоты. Во-вторых, H₂О₂ могут продуцировать пероксидазы клеточной стенки.

Для ROS предполагается несколько ролей в защите растения. Например, H₂О₂ может непосредственно быть токсичной для микробов на уровнях, которые продуцируются в растениях. H₂О₂ также может вносить вклад в структурное упрочнение клеточных стенок растения; H₂О₂ необходима для образования предшественников лигниновых полимеров посредством активности пероксидазы и было показано, что обогащенные гидроксипролином и пролином гликопротеины клеточной стенки быстро окислительно сшивались в клеточных стенках после обработки грибным элиситором. Это поперечное сшивание белков также снижает «доступность протопласта», таким образом делает клеточную стенку растения более устойчивой к микробному проникновению и ферментативной деградации.

Также вероятна сигнальная роль для H₂О₂. H₂О₂ повышает ферментативную активность гидрокислазы бензойной кислоты, которая необходима для биосинтеза салициловой кислоты (SA). Кроме того, H₂О₂ активирует некоторые защитные механизмы, например, экспрессию гена глутатион-S-трансферазы, в смежных клетках.

Вероятно, генерация ROS будет приводить к изменению окислительно-восстановительного баланса в реагирующей клетке. У млекопитающих, многие факторы транскрипции, такие как ROS-отзывчивый фактор NF-kB, как известно, регулируются окислительно-восстановительным состоянием. Подобное может происходить и у растений. Имеются данные, которые наводят на мысль, что O₂^{∙ ─} может быть одним из сигналов, который координирует индукцию генов защиты растения.

Оксид азота привлек значительный интерес фитопатологов благодаря установленной его роли в регуляции антимикробной защиты у млекопитающих, в частности через программируемую клеточную гибель (PCD).

NO действует как сигнальная молекула у видов всех биологических царств, эта особенность обусловлена его физическими свойствами, которые обеспечивают ему исключительно богатую химическую активность. NO высоко реактивный, благодаря присутствию неспаренного электрона, и подобно кислороду, он может существовать в виде ряда восстановленных состояний, ^–NO (нитроксильный ион, nitroxyl ion), NO и ⁺NO (ион нитрозония, nitrosonium ion), и в каждом из них реактивные промежуточные соединения азота (reactive nitrogen intermediate (RNI)) способны осущетсвлять специфические взаимодействия. ^·NO способен реагировать с атмосферным O₂ с образованием NO₂. Далее, NO является замечательно мобильной молекулой, способной легко пересекать мембраны, и, поскольку он мало растворим в водных растворах, он легко переходит в газообразную фазу. Это заметно повышает его потенциал как сигнальной молекулы.

В биологических системах, NO вмешивается в пути передачи сигналов посредством целого ряда действий. Многие эффекты NO обусловлены окислительным повреждением, связанным с образованием потенциального оксиданта пероксинитрата через взаимодействие с суперокисидом (NO + O₂^– → ^–ONOO). Менее жестким действием является электрофильная атака со стороны ^·NO тиоловых групп, в частности остатков цистеина, что приводит к S-нитрозилированию молекул, таких как глутатион или белки. S-нитрозилирование может модулировать активность белка; например, мономерной связывающий GTP белок, p21ras, активируется S-нитрозилированием, тогда как, в противоположность этому, киназа JNK1 при этом инактивируется.

Альтернативно NO может модифицировать белки посредством нитрирования, в частности остатков тирозина. Сродство NO к переходным металлам (например Fe²⁺/Fe³⁺), приводит к формированию комплексов железо-нитрозил; такое взаимодействие также используется для регуляции биологической активности. Это взаимодействие является центральным в классическом пути передачи сигналов, в котором NO связывается с группами гема растворимой и ассоциированной с мембраной гуанилилциклазы (guanylyl cyclase), что приводит к изменению конфигурации и активации энзиматической продукции cGMP из GTP. Увеличение уровня cGMP повышает активность киназы (NO-G-kinase) и фосфодиэстразы, которые влияют на регуляцию cGMP ионных каналов. Одной из хорошо документированных целей NO-G-киназы является легкая цепь миозина.

Другое важное взаимодействие включает связывание NO с группами гема в пределах ферментов P450, и это ингибирует их активность. Особенно интересным является взаимодействие NO с гемоглобином (Hb), поскольку этот комплекс имеет способность доставлять, запасать и окислять (детоксифицированть) NO. Гемоглобины растений, как было показано, реагируют с NO с образованием NO₃ при аэробных условиях в двустадийном процессе. На первой стадии, NO окисляет гем с образованием метагемоглобина, из которого NO₃ высвобождается после восстановления редуктазой, содержащей NADPH или флавин. Этот путь представляет механизм, посредством которого уровни NO быстро изменяются в биологических системах.

NO/пероксинитрит может также обратимо нарушать активность ферментов, содержащих в активном центре железо и серу (4Fe-4S) посредством cluster co-ordination, что приводит к потере железа ([4Fe-4S]²⁺+ONOO^– + H⁺ → [3Fe-4S]⁺ + NO^– + ^·NO₂ + Fe²⁺, которая затрагивает энзиматическую активность. Хорошо охарактеризованными целями в подобном случае является фермент цикла Кребса аконитаза, которая катализирует изомеризацию цитрата в изоцитрат и комплексы I и II в электрон-транспортной цепи. Таким образом, взаимодействие NO/белок 4Fe-4S будет усиливать окислительный стресс посредством нарушения функций митохондрий и посредством способствованию образованию реактивного гидроксильного радикала через реакцию Фентона (Fenton reactions) (Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + HO^– + ^·HO).

В биологических системах, NO может генерироваться ферментативным путем и неферментативно. Наиболее хорошо описанными ферментами, продуцирующими NO, явлюется синтаза оксида азота (nitric oxide synthase (NOS)) и нитратредуктаза (NR). NOS катализирует двухстадийное окисление L-аргинина в NO и цитруллин (L-аргинин + NADPH₂ + O₂ → N ^ω-гидроксиаргинин → + NADPH₂ + O₂ → L-цитруллин + NO); данная реакция может также катализироваться цитохромом P450. NR генерирует NO из нитрита с использованием NADPH в качестве донора электронов. Много усилий специалистов в биологии растений ранее было направлено на поиск NOS растений. Ферментативное окисление L-аргинина в L-цитруллин с образованием NO сообщалось для экстрактов из люпина, сои, табака и кукурузы. Конкурентные ингибиторы на основе L-аргинина подавляли продукцию NO у сои, арабидопсиса и табака, указывая на вовлечение активности NOS. В дальнейшем было показано, что антитела против NOS млекопитающих связываются со специфическим белком растений; при этом антигенные детерминанты были локализованы в пероксисомах. Однако специфичность этих антител в растениях далее была подвергнута сомнению и, наконец, в геноме арабидопсиса не были найдены гены с гомологией по отношению к NOS млекопитающих. Однако Guo et al. (2003) идентифицировали NO-генерирующий фермент, AtNOS1, что распутало эти противоречивые данные. Хотя AtNOS1 (≈60 kDa) намного меньше, чем NOS млекопитающих и не проявляет гомологии последовательности по отношению к последним, она связывает антитела к NOS млекопитающих и явно продуцирует NO посредством окисления аргинина.

Несмотря на идентификацию гена NOS растений, очевидные доказательства показывают, что растения могут продуцировать ^·NO из нитрита с помощью NADPH-зависимой нитратредуктазы (NO₃ → NO₂ → ^·NO + O₂). Использование высоких уровней нитратов при условиях аноксии увеличивает продуцирование NO. Более того, заражение не имеющего NRдвойного мутанта арабидопсиса nia1 nia2 бактериальным патогеном Pseudomonas syringae pv. maculicola позволило установить, что NR была основным источником NO в течение взаимодействия растение-патоген, со значительно меньшим вкладом от NOS-подобной активности. Также допускается, что NO может образовываться посредством неферментативного восстановления нитрита (2NO₂ + 2H⁺ ↔ 2HNO₂ → NO + NO₂ + H₂O), однако этой реакции благоприятствуют только кислые условия, подобные тем, которые обнаруживаются в апопласте алейронового слоя ячменя.

Укрепление клеточных стенок

Микробы должны преодолеть кутикулу растения и/или клеточную стенку для того, чтобы достигнуть клетки, хотя проникновение может иногда происходить через повреждения или естественные отверстия. Укрепление клеточной стенки растения может повысить устойчивость несколькими путями. Для внеклеточных биотрофов, таких как Pseudomonas syringae или Cladosporium fulvum, уплотнение клеточных стенок может затруднять утечку цитоплазматического содержимого, таким образом снижая доступность питательных веществ для патогена. Для некротрофов, таких как Botrytis cinerea, которые зависят от гидролиза клеточных стенок растения для продвижения растущих гиф, диффузия токсинов и ферментов к чувствительным клеткам растений будет замедлена. Кроме того, низкомолекулярные фенольные предшественники лигнина и свободные радикалы, образующиеся в течение реакций полимеризации в клеточных стенках растений, могут нарушать пластичность мембран патогена или инактивировать токсины и ферменты. Сами гифы также могут стать лигнифицированными. Для гаусториальных биотрофов, предотвращение входа гриба в клетку растения будет предотвращать паразитизм.

Одним из типов укрепления стенки, который быстро протекает в ответ на внедрение гриба, является формирование папилл. Папиллы часто образуются под гифой проникновения и являются гетерогенными по составу; они, как считается, физически блокируют проникновение гриба в клетку хозяина.

Быстрое отложение каллозы в клеточных стенках также часто ассоциировано с сайтом несовместимости с патогенном. Блокировка плазмодесм каллозой является существенным компонентом защиты, необходимым для задержки движения вирусов из клетки в клетку.

Основные обогащенные гидроксипролином белки, как считают, играют ключевую роль в организации архитектуры первичной клеточной стенки и могут действовать как очаги инициации полимеризации лигнина. Быстрое окислительное поперечное сшивание сформированных заранее HRGPs через или меж- или внутримолекулярные изодитирозиновые связи может представлять один из наиболее ранних защитных откликов, сопровождающих окислительную вспышку.

Дополнительным, но вероятно более слабым механизмом, который помогает становиться клеточным стенкам более непроницаемыми, является локальное повышение в них содержания лигнина.