Транспорт Т-ДНК в ядро клетки растения

Поскольку патогенные микроорганизмы часто используют существующие клеточные механизмы хозяина для их собственных потребностей, Agrobacterium вероятно использует эндогенный клеточный путь для транспорта вторгающегося T-комплекса в ядро клетки растения. T-комплекс Agrobacterium был использован как модельная система, чтобы исследовать общий процесс ядерного импорта нуклеиновых кислот в клетках растения. Размер T-комплекса (50 000 kD) предполагает необходимость активных транспортных процессов. Поскольку T-цепь самостоятельно не несет сигналы нацеливания, ядерный импорт T-комплекса наиболее вероятно опосредуется белками VirD2 и VirE2.

Как правило, у эукариот активный ядерный импорт белков требует специфического сигнала ядерной локализации (NLS). Детальные исследования позволили выяснить, что функциональный сигнал ядерной локализации действительно имеется у белка VirD2 который присоединен к 5’ концу T-цепи, и исследования с мутантами показали, что он действительно активен в направлении T-комплекса в ядро клетки хозяина. Однако VirD2 – не единственный посредник ядерного поглощения T-комплекса. Впоследствии была показана ядерная локализация VirE2, главного структурного компонента T-комплекса. У этого белка были идентифицированы два функциональных NLS. Хотя каждый из сигналов ядерной локализации белка VirE2 был независимо активным, максимально эффективный ядерный импорт VirE2 требовал присутствия обоих сигналов.

В Agrobacterium, содержащей нопалиновую Ti-плазмиду, T-цепь связана с одной молекулой VirD2 и 600 молекулами VirE2. Каждая молекула VirE2 несет два NLS, тогда как VirD2 содержит один функциональный NLS. Почему тогда Agrobacterium нуждается в NLS на VirD2 вообще? Было высказано предположение, что белки VirD2 и VirE2 импортируются в ядро клетки растения функционально различными последовательностями нацеливания и что оба сигнала требуются для оптимального ядерного импорта T-комплекса.

У эукариотических организмов, распознавание сигнала ядерной локализации белка происходит через взаимодействие NLS с клеточными рецепторами, обычно принадлежащими к семейству белков кариоферинов. Введенный в клетку животных белок VirD2 быстро оказывался в ядре; таким образом, сигнал ядерной локализации этого белка является функциональным и в клетках растений, и в клетках животных. В отличие от VirD2, веденный в клетки животных VirE2 оставался в цитоплазме; таким образом, сигналы ядерной локализации этого белка не распознаются в системе животных и поэтому являются специфическими для растений. Таким образом, возможно, что клетки растения имеют набор рецепторов NLS, которые отсутствуют в клетках животных.

Ядерный импорт T-комплекса Agrobacterium достигает кульминации при интеграции транспортированной T-цепи в хромосому клетки растения-хозяина. Молекулярные механизмы, которыми это достигается, в значительной степени неизвестны. В отличие от других мобильных элементов ДНК типа транспозонов и ретровирусов, T-ДНК не кодирует никаких ферментов, которые могут обусловить интеграцию. Таким образом, вставка T-ДНК в геном растения должна опосредоваться белками, транспортированными из инфицирующей бактерии и/или факторами клетки хозяина.

В сравнительно недавних исследованиях было установлено, что оба связанных с T-цепью белка, и VirD2 и VirE2, не только направляют Т-ДНК в ядро, но и вовлечены в процесс интеграции. Т-ДНК является одноцепочечной, и вначале предполагалось, что интеграция предшествует синтезу второй цепи, который может выполнятся механизмами репарации ДНК клетки растения после интеграции T-цепи. Однако более поздние исследования особенностей интеграции T-ДНК привели к предложению, что T-цепи конвертируются в двухцепочечную форму перед интеграцией.

Изучение процесса интеграции Т-ДНК в геном растения позволил получить предположительный ответ на вопрос, почему Agrobacterium поражает только двудольные растения. Оказалось, что в основе устойчивости кукурузы и возможно других однодольных растений к заражению Agrobacterium лежит блокирование интеграции T-ДНК.