Нарушение метаболизма растений с помощью токсинов

После проникновения, следующим шагом стратегии гриба в колонизации растения является секреция токсинов или веществ с гормональной активностью, которые изменяют физиологию растения в сторону, благоприятную для патогена. Такое вмешательство в метаболизм растения может состоять просто в убийстве клеток растений и использования их для питания, или в более тонкой переориентации клеточных процессов; часто эта цель достигается выделением продуцирования фитопатогенным грибом фитотоксинов, которые имеют варьирующую степень специфичности по отношению к различным растениям.

Фитотоксины идентифицированы у большого количества патогенов, но их действительная роль в патогенеза в большинстве случаев остается плохо понятной и спорной. Однако, в некоторых взаимодействиях растение-гриб, генетические и биохимические исследования показали, что токсины являются детерминантами специфичности гриба. В этих случаях, устойчивость или восприимчивость к грибу всегда высоко коррелирует с нечувствительностью или чувствительностью к токсину. Эти специфические для хозяина токсины продуцируются в основном грибами родов Alternaria и Cochliobolus.

Специфические фитотоксины.

Специфические токсины по отношению к чувствительным сортам и линиям растений активны при концентрациях в пределах от ~10 pM до 1 μM, и их степени специфики (селективности для хозяина) находятся в диапазоне от 100-кратной до >10⁶-кратной. Несмотря на их название, не все токсины токсичны при всех условиях. HC-токсин, например, не только не убивает неделящиеся протопласты мезофилла листа, но фактически способствует их выживанию.

T-токсин

T-токсин производится изолятамирасы T C. heterostrophus. Раса T C. heterostrophus очень вирулентная для линий кукурузы, обладающих цитоплазматической мужской стерильностью техасского типа (Tcms). Раса 0 C. heterostrophus, которая не производит T-токсин, является второстепенным патогеном кукурузы независимо от цитоплазмы. Исследование относительно C. heterostrophus раса T и ее токсина стимулировались эпидемией Южного гельминтоспориоза кукурузы в 1970, случаем, который сосредоточил внимание на генетической уязвимости главных хлебных злаков. Эта эпидемия произошла из-за все более и более широкого распространения использования Tcms, экономичной альтернативы ручного удаления метелок в производстве гибридов кукурузы в течение 1960-ых. К 1970, большинство гибридных семян, выращенных в Соединенных Штатах, имело Tcms, и в том же году погодные условия были благоприятны для развития Южного гельминтоспориоза кукурузы.

T-токсин активен при ~10 nM у Tcms кукурузы и при ~10 μM у кукурузы с нормальной цитоплазмой. Чувствительны к токсину митохондрии растений. Основа чувствительности к T-токсину – перегруппировка митохондриального генома Tcms растений, которая приводит к синтезу химерного белка URF13, локализованного во внутренней митохондриальной мембране. Физические и биохимические исследования указывают, что URF13 формирует олигомерные поры в мембранах митохондрий в присутствии T-токсина.

Викторин

Викторин был одним из первых обнаруженных HST; он имеет высокую токсичность (эффект был зарегистрирован при 10 pM). C. victoriae (причина увядания овса Виктория) отрицательно воздействовал на экономику Соединенных Штатов в течение 1930-ых, вызывая главные эпидемии овса. Происхождение эпидемии увядания Виктории связано с модификацией генома овса. В 1930-ых, серьезной болезнью овса была корончатая ржавчина, вызванная Puccinia coronata. Обнаруженный в Уругвае ген Pc-2 обеспечивает хорошую устойчивость к P. coronata, и он был внедрен в основные сорта овса в Соединенных Штатах, в первую очередь сорт Виктория. Вскоре появилось ранее неизвестное увядание, которое специфически поражало сорта овса с геном Pc-2. Ген, который обеспечивает восприимчивость к C. victoriae, названный Hv-7 или Vb, является или тем же самым геном, что и Pc-2, или очень сильно связанным.

Как это ни парадоксально, несмотря на длительное изучение, точный механизм действия викторина остается неизвестным. Предполагается, что он связывается с одной из субъединиц декарбоксилазы глицина (GD) – сложного фермента с 42 субъединицами четырех типов. Фермент локализован в митохондриях и играет центральную роль в цикле фотодыхания. Викторин специфически ингибирует GD в растительных тканях, но он не оказывает никакого эффекта на GD в выделенных, неповрежденных митохондриях, из-за отсутствия поглощения. В интактных тканях, викторин накапливается в митохондриях чувствительных клеток, но не в митохондриях устойчивых клеток. Возможно, продукт гена Hv-7 может контролировать поглощение митохондриями или метаболизм викторина.

HC-токсин

Восприимчивость к C. carbonum раса 1 и чувствительность к его токсину, HC-токсину, контролируется двумя генами кукурузы, Hm1 и Hm2. Устойчивая кукуруза имеет ферментативную активность редуктазы HC-токсина, которая детоксифицирует HC-токсин. Эта ферментативная активность также присутствует в экстрактах других трав (овес, пшеница, и ячмень), но не обнаружима в экстрактах нескольких двудольных растений. Основа нечувствительности двудольных к HC-токсину не известна.

HC-токсин ингибирует рост корнякукурузы, но не токсичен для клеток. Он имеет цитостатическую, но не цитотоксическую активность по отношению к клеткам млекопитающих. Современное доказательство указывает, что сайт действия HC-токсина – деацетилаза гистонов (HD), фермент, который обратимо деацетилирует внутренние гистоны (H3 и H4), когда они собраны в хроматине. Ацетилирование и деацетилирование внутренних гистонов изменяют индуцибельность и супрессивность некоторых классов генов, но детали того, как это происходит, не выяснены. HC-токсин ингибирует HD кукурузы, вызывая накопление ацетилированных гистонов in vivo.

В настоящее время исследователи пытаются понять, как ингибирование активности HD способствует заражению кукурузы C. carbonum раса 1. Тогда как другие специфические токсины, типа T-токсина и викторина, ингибируют центральные метаболические процессы в чувствительных тканях, приводя к гибели клеток, процесс ацетилирования/деацетилирования гистонов не является в достаточной степени понятым, чтобы можно было предсказать, почему ингибирование HD должно вызвать восприимчивость к болезни. Исследования с использованием дрожжевых гистоновых мутантов и ингибиторов HD указывают, что вмешательство в ацетилирование гистонов не летально для клеток, но нарушает нормальное развитие эмбрионов и нормальное регулирование генов. Одно возможное объяснение действия HC-токсина – то, что он способствует заражению, интерферируя с индукцией генов защиты кукурузы, то есть препятствует индукции защитных реакций растения.

В заключение следует упомянуть, что специфические фитотоксины не являются попросту метаболическими ядами, убивающими клетки растения. Для проявления их токсического действия необходимо активное участие метаболизма клетки хозяина; например, их токсический эффект не проявляется в случае ингибирования синтеза белка в клетки растения. В последнее время накапливается все больше экспериментальных данных, которые свидетельствуют о том, что гибель клеток растения обусловлена внутренними механизмами и представляет собой фактически защитную реакцию растения ­ – реакцию сверхчувствительности. Если это так, то некротрофные патогены ­– продуценты специфических фитотоксинов – фактически индуцирую реакцию устойчивости, эффективную против биотрофных и некротрофных патогенов, и в дальнейшем используют ее результат к собственной выгоде.

Неспецифические фитотоксины

Неспецифические фитотоксины активны как для растений-хозяев, так и нехозяев. Такая неселективность, очевидно, противоречит роли для токсина в детерминации диапазона растений-хозяев. Тем не менее, эти токсины могут выполнять определенную функцию в течение патогенеза гриба на конкретном хозяине. Альтернативно, они могут интерпретироваться как своего рода рудименты более ранних стадий эволюции гриба в направлении фитопатогенности, активность которых может быть блокирована в большинстве растений детоксификацией или другими механизмами.

Значение неспецифических токсинов грибов в патологическом процессе остается мало понятным. Эти токсины не являются детерминантами патогенности или вирулентности. В то же время возможно, что оно недооценивается. Хотя механизм действия неспецифических токсинов остается в большинстве случаев неизвестным, тем не менее есть данные, что они могут затрагивать фундаментальные процессы метаболизма.

Фитопатогенные бактерии. В отличие от грибов, фитопатогенные бактерии не могут проникать через неповрежденные покровные ткани растений. В то же время большинство бактерий являются достаточно маленьким, чтобы проникнуть через устьица и другие естественные отверстия в апопласт. Тем не менее, на растениях паразитирует удивительно малое число бактерий. Это свидетельствует о потребности в определенных свойствах, которые необходимы для бактерии для того, чтобы стать фитопатогенной.

Большинство фитопатогенных бактерий являются грамотрицательными. Особенности грамположительных бактерий изучены хуже. Фитопатогенные бактерии паразитируют в межклеточных пространствах различных органов расте­ний или в ксилеме. Они раньше или позже вызывают гибель клеток растений, то есть являются некрогенными.

В отношении специализации по видам растений, на которых они паразитируют, можно отметить, что ряд бактерий имеет широкой круг хозяев, в то время как отдельные патовары других бактерий паразитируют на ограниченном числе видов.

Как и фитопатогенные грибы, фитопатогенные бактерии можно разделить на некротрофные и биотрофные. Некротрофными являются, например, Erwinia ca­rotovora E. chrysan­themi, вызывающие мягкие гнили многих растений. Биотрофными являются большинство представителей родов Pseudomonas, Ralstonia и Xanthomonas, а также Erwinia amylovora.

Паразитизм грамотрицательных бактерий зависит от нескольких особенностей. Одна из основных предпосылок – наличие так называемых hrp (гарп) генов. При нарушении функции любого из этих генов бактерии перестают вызывать реакцию сверхчувствительности при заражении растений-нехозяев, а также утрачивают способность к паразитизму на растениях-хозяевах. Иначе говоря, мутанты по генам hrp ведут себя подобно непатогенным бактериям. Таким образом, наличие функциональных генов hrp является обязательным условием для паразитизма фитопатогенных бактерий. Ряд этих генов кодируют компоненты системы секреции белка типа III, которая, по всей видимости, позволяет доставлять бактериальные белки внутрь клеток хозяина.

Однако наличие генов hrp является необходимым, но недостаточным условием для патогенеза на растениях. Например, когда кластеры этих генов внедряли в сапротрофные бактерии P. fluorescens или E. coli, эти бактерии начинали вызывать реакцию сверхчувствительности у многих растений, но не могли вызвать болезнь, то есть не становились фитопатогенными. Для патогенеза на растениях необходимы дополнительные факторы.

Одним из таких факторов являются эффекторы патологического процесса, чаще всего белковой природы. Эти белки доставляются в растительную клетку системой секреции типа III, и несмотря на то, что их функция плохо понятна, считается, что они в частности подавляют защитные реакции растения.

Кроме этого, имеются другие факторы, обуславливающие вирулентность бактерий. К таким факторам относят в частности токсины. Токсины, продуцируемые некрогенными грамотрицательными патогенами (прежде всего патоварами P. syringae) являются вторичными метаболитами (главным образом маленькие пептиды). Они не выявляют никакой специфичности по отношению к хозяину, типично не вносят вклад в размножение бактерий в растениях, легко диффундируют и часто вызывают характерные повреждения. Бактериальные токсины, как полагают, являются факторами вирулентности.

Фактические роли индивидуальных токсинов в патогенезе все еще неясны. Токсины продуцируются некоторыми нефитопатогенными штаммами P. syringae, и многие из них также имеют антибактериальную активность и таким образом могут первично функционировать как факторы конкуренции бактерий в течение эпифитной стадии развития. В некоторых случаях гены, обусловливающие биосинтез токсина, могут быть удалены без влияния на патогенность бактерий. В то же время ряд токсинов, как считают, вносят вклад в патологический процесс, по крайней мере, на ранней стадии.

Еще одним фактором вирулентности являются внеклеточные полисахариды. Внеклеточные полисахариды, в отличие от токсинов, производятся большинством бактерий, включая многих патогенов растений, и секретируются как свободная слизь или как материал капсулы. Они, как полагают, защищают свободноживущие бактерии от разнообразных экологических стрессов и могут способствовать патогенезу, поддерживая насыщение водой межклеточного пространства, снижая доступность бактериальных клеток для антибактериальных соединений, нарушая распространение сигналов, активирующих защиту растений, и блокируя ксилему, таким образом, вызывая симптомы увядания. Исследования мутантов этих бактерий выявило, что внеклеточные полисахариды вообще являются фактором вирулентности, внося вклад в формирование симптомов увядания и водянистости тканей. При этом они не являются абсолютно необходимыми для патогенеза, и не имеют никакой специфичности для хозяина. Следует отметить, что фитопатогенные бактерии, как и все остальные бактерии, в естественных условиях образуют биопленки, и динамика развития биопленок и их свойства во многом связаны с составом внеклеточных полисахаридов. В свою очередь этот состав подвержен изменениям в зависимости от этапов развития биопленки и регулируется в частности таким явлением, как ощущение кворума.

Следующим фактором вирулентности бактерий являются пектиназы. Все деградирующие клеточную стенку ферменты бактерий экспортируются из клеток посредством системы секреции типа II. Бактериальная мягкая гниль, вызываемая некротрофными патогенами E. carotovora, E. chrysanthemi и P. viridiflava, существенно отличается от болезней, вызванных биотрофными патогенами. Эти бактерии имеют широкий диапазон хозяев, особенно среди растений с мясистыми паренхиматическими тканями, степень развития болезни больше зависит от экологических условий, которые ослабляют хозяина. Патогенез определяется пектиновыми ферментами, которые расщепляют α-1,4-галактуронозильные связи в полимерах клеточной стенки растения посредством гидролиза (полигалактуроназы) или β-элиминирования (пектат- или пектинлиазы). Из-за структурной важности и уникальной доступности пектиновых полимеров в первичных клеточных стенках и срединных пластинках двудольных и некоторых однодольных растений, пектиновые ферменты – существенное оружие патогенеза с использованием, так сказать, грубой силы, и они вызывают как гибель клеток, так и мацерацию ткани, то есть первичные признаки мягкой гнили.

Патогенез Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens является фитопатогеном почвы, который генетически трансформирует хозяина, вызывая корончатые галловые опухоли, важную болезнь, которая затрагивает большинство двудольных растений. В природе, эти опухоли обычно формируются на границе воздух-почва, так называемой короне растения. Взаимодействие Agrobacterium –клетка растения – единственный известный природный пример транспорта ДНК между царствами. В этом процессе, ДНК транспортируется из дикого типа Agrobacterium в ядро клетки растения. Экспрессия этой перемещенной ДНК (T-ДНК) имеет результатом неопластический рост (опухоли) на растении-хозяине.

Для трансформации клетки растения требуются три генетических компонента Agrobacterium. Первый компонент – T-ДНК, которая физически транспортируется из бактерии в клетку растения. T-ДНК – дискретный сегмент ДНК, расположенной на 200-kb Ti-плазмиде Agrobacterium; она ограничена двумя 25-bp неполными прямыми повторениями, известными как границы T-ДНК. Второй компонент – 35-kb область вирулентности(vir), также расположенная на Ti плазмиде, которая состоит из семи главных локусов (virA, virB, virC, virD, virE, viG и virH). Белковые продукты этих генов, которые называют белками вирулентности (Vir), отвечают на специфические вещества, секретируемые поврежденным растением, чтобы произвести копию T-ДНК, и опосредуют ее перемещение в клетку хозяина. Третий компонент – набор хромосомных генов вирулентности (chv), расположенных на хромосоме Agrobacterium. Гены chv вовлечены в хемотаксис бактерии и прикрепление к поврежденной клетке растения.

Поскольку элемент T-ДНК определен границами, область кодирования дикого типа T-ДНК может быть заменена любой последовательностью ДНК без какого-либо влияния на ее перемещение из Agrobacterium в растение. Таким образом, Agrobacterium часто используется, чтобы произвести трансгенные растения, экспрессирующие интересующие гены.

Восприятие сигналов поврежденного растения. Поврежденные растения секретируют сок с характерным кислым pH (от 5.0 до 5.8) и высоким содержанием различных фенольных соединений, типа предшественников флавонидов и лигнина. Эти условия специфически стимулируют экспрессию vir генов Agrobacterium. Лучше всего охарактеризованные и самые эффективныеиндукторы генов vir – моноциклические фенольные вещества типа ацетосирингона (AS). Эти молекулы не обнаружены, или обнаружены на низких уровнях, у неповрежденных растений, но их количество значительно увеличивается в поврежденных клетках растений.

Сигналы растения воспринимаются сенсорной двухкомпонентной системой бактерий, которая состоит из мембранной сенсорной киназы и цитоплазматического регуляторного белка. У Agrobacterium имеется двухкомпонентная система трансдукции сигнала, состоящая из белков вирулентности VirA и VirG. Вместе, эти белковые молекулы чувствуют сигнальные молекулы, секретируемые поврежденными клетками растения, и активируют экспрессию других vir генов, таким образом инициируя процесс транспорта T-ДНК. Сенсорным компонентом является белок VirA, являющийся сенсорной киназой. Сигналы растения активируют VirA, после чего эта киназа автофосфорилируется в остатке His-474, а затем фосфатная группа переносится на остаток аспарагина белка VirG. Белок VirG взаимодействует с так называемым vir -боксом, то есть с консервативной последовательностью из 12 нуклеотидов в регионах промотора индуцибельных vir генов на Ti-плазмиде.

Прикрепление Agrobacterium к клеткам растения-хозяина является предпосылкой для передачи ДНК. Распознавание Agrobacterium –клетка хозяина – процесс из двух шагов. На первом шаге, бактерии свободно связывают с поверхностью клетки хозяина, и на втором связанные бактерии синтезируют нити целлюлозы, которые стабилизируют начальное закрепление, приводя к тесной ассоциации между Agrobacterium и клеткой хозяина.

Показано, что каждая клетка растения связывает конечное число бактерий; поэтому считают, что в связывание вовлечены насыщаемые поверхностные рецепторы растения. У животных белок внеклеточного матрикса витронектин функционирует как рецептор для нескольких бактериальных штаммов. Подобные витронектину молекулы, которые были найдены на поверхности клетки многих видов растений, могут обусловить закрепление Agrobacterium на клетке растения. Витронектин человека, так же как антитела против витронектина, блокируют прикрепление Agrobacterium к культивируемым клеткам растения. Далее, штаммы Agrobacterium, которые являются неспособными связать клетки растения из-за мутаций в их хромосомныхлокусах chvB, pscA или att, также выявляют уменьшенное прикрепление к витронектину. Потенциально, подобный витронектину белок (PVN) растений может представить один из рецепторов, ответственных за специфическое взаимодействие между Agrobacterium и клетками растения. Интересно, недавние данные указывают, что PVN связаны с витронектином животных только иммунологически и что никакое подобие последовательности аминокислот не существует между этими белками. В дополнение к PVN, другие белки и углеводы поверхности клетки растения, вероятно, могут быть вовлечены во взаимодействие с Agrobacterium. Однако эти молекулы еще не идентифицированы.

Образование переносимой Т-нити

Индукцияэкспрессии генов vir в конечном счете имеет одним из результатов производство копии T-ДНК, которая является способной к генетическому преобразованию клеток растения. Различные типы Ti-плазмид несут элементы T-ДНК различного состава. Например, T-ДНК в нопалиновой Ti-плазмиде – непрерывный отрезок ~22 kb. Интересно, что T-ДНК как таковая не оказывает никакого влияния на эффективность перемещения. Поэтому неонкогенные («разоруженные») Ti-плазмиды, с большинством внутренних последовательностей T-ДНК, замененных интересующей ДНК, широко используются как векторы для генетической трансформации растений.

Клетки Agrobacterium с индуцированными генами vir производят линейную одноцепочечную копию области T-ДНК, обозначенную как T-цепь. T-цепь обнаруживается приблизительно в одной копии на индуцированную клетку Agrobacterium. Белки VirDl и VirD2 вместе функционируют как эндонуклеаза, которая выполняет сайт - и цепь-специфические разрезы в участке границ T-ДНК. После расщепления, VirD2 ковалентно прикрепляется к 5′ концу T-цепи. Вырезаемая T-цепь удаляется, и результирующий одноцепочечный промежуток восстанавливается, наиболее вероятно обновленным синтезом ДНК.

Есть сильные параллели между метаболизмом T-ДНК и эволюционно родственным процессом бактериальной конъюгации, которая происходит у большинства бактерий, включая Agrobacterium как таковую. Кратко можно сказать, что система вирулентности Agrobacterium, по-видимому, родственна транспортной системе некоторых плазмид. Хотя, конечно, главное функциональное различие состоит в том, что T-цепь направляется не в другую бактерию, а в ядро эукариотической клетки растения-хозяина.

В середине 1990-х годов были получены прямые доказательства, что в клетку растения и в ее ядро перемещается именно одноцепочечная, а не двухцепочечная, ДНК.

Считают, что T-цепь перемещается из бактерии и в клетку растения как комплекс белок–нуклеиновая кислота. Это промежуточное звено транспорта T-ДНК, названное как T-комплекс, состоит, по крайней мере, из трех компонентов, а именно, из самой молекулы ДНК T-цепи, а также связанных с нею белков VirD2 и VirE2, которые защищают T-цепь, формируют ее в передаваемый (тонкой и развернутый) форме и снабжают специфические сигналы нацеливания. Как было сказано, после разрезания ДНК Ti-плазмиды при посредстве белков VirDl и VirD2, которые вместе действуют как эндонуклеаза, одна молекула белка VirD2 ковалентно присоединена к каждой T-цепи. Также ассоциированным с T-цепью является белок VirE2, который имеет свойство связывать одноцепочечную ДНК. Связывание VirE2 с одноцепочечной ДНК in vitro является сильным и кооперативным, что приводит к формированию очень устойчивых развернутых комплексов VirE2-ssDNA, которые являются в значительной степени устойчивыми к внешней нуклеолитической активности. На основании данных электронной микроскопии и кинетики связывания белка VirE2 in vitro предполагается, что нопалин-специфические T-комплексы имеют 3600 nm в длину и 2 nm в ширину. Они содержат ~ 600 молекул VirE2 и одну молекулы VirD2 и имеют предсказанную молекулярную массу 50 000 kD.