Тема 1. Иммунитет как общебиологическое явление. Особенности иммунитета растений.

Явление толерантности.

Особое положение в фитоиммунологии занимает понятие «толерантность», или выносливость. Под толерантностью понимают способность растений не снижать или почти не снижать урожай даже при сильном поражении фитопатогенным организмом. Явление толерантности имеет неясные механизмы, и больше о нем вспоминать мы не будем.

«Треугольник болезни» (патоген–хозяин–окружающая среда).

Инфекционное заболевание растения происходит тогда, когда имеется в наличие восприимчивое растение, вирулентный фитопатоген, и условия окружающей среды благоприятствуют заболеванию. Окружающие условия оказывают достаточно существенное влияние на патологический процесс. Влажность, температура, условия освещенности, присутствие других микроорганизмов влияют на растение, микроорганизм, а также на сам ход патологического процесса. Экологические условия могут как усиливать пораженность растения, так и ослаблять ее. Окружающие условия слабее влияют в случае иммунности растения, но оказывают более заметное действие на степень устойчивости. Например, высокая температура почти всегда снижает устойчивость растения. В связи с этим часто говорят о так называемом «треугольнике болезни», подразумевая под этим треугольником тот факт, что течение конкретного заболевания зависит от устойчивости растения, вирулентности патогена и условий окружающей среды.

Особенности защитных реакций растений. Активный и пассивный иммунитет растений.

Растения, в отличие от позвоночных животных, лишены антител и способности к фагоцитозу; не имеют кровеносной системы и гуморальных факторов иммунитета. Взамен этого каждая растительная клетка должна обладать сформированной заранее и/или индуцируемой защитой; кроме этого, сайт заражения у растений часто является источником системно распространяющегося сигнала, который индуцирует системную приобретенную устойчивость.

У растений, как и у животных, различают два типа иммунитета: врожденный (естественный) и приобретенный (или индуцированный).

Врожденный иммунитет – это свойство растений не поражаться тем или иным возбудителем заболевания, которое обусловлено генотипом растения и передается по наследству.

Все случаи врожденного иммунитета подразделяются на две категории – пассивный иммунитет и активный иммунитет. Пассивный иммунитет существует независимо от наличия паразита, и определяется анатомо-морфологическими или биохимическими особенностями растения, например толщиной кутикулы или содержанием некоторых ингибирующих веществ.

Активный иммунитет проявляется в виде защитных реакций растения на внедрение и воздействие патогена.

Приобретенный иммунитет – это свойство, которое возникает после перенесенного заболевания или при воздействии некоторых химических или физических факторов, в частности ионов металлов или облучения ультрафиолетом.

ТЕМА 2. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТРОФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ФИТОПАТОГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ, ТИПЫ ИХ СПЕЦИАЛИЗАЦИИ И ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА

Облигатные сапротрофы, факультативные паразиты, факультативные сапротрофы, облигатные паразиты. Некротрофы, биотрофы, гемибиотрофы. Монофаги, олигофаги и полифаги. Органотропная и/или тканевая специализация патогенов. Особенности патологических процессов, вызываемые фитопатогенными вирусами, бактериями, оомицетами и грибами. Патогенез Agrobacterium tumefaciens: восприятие сигналов поврежденного растения, образование переносимой Т-нити, транспорт Т-комплекса в клетку растения, транспорт Т-ДНК в ядро клетки растения.

Облигатные сапротрофы, факультативные паразиты, факультативные сапротрофы, облигатные паразиты. Некротрофы, биотрофы, гемибиотрофы. Монофаги, олигофаги и полифаги. Органотропная и/или тканевая специализация патогенов.

С точки зрения экологических особенностей, точнее по соотношению сапротрофной и паразитической фаз в жизненном цикле микроорганизма, еще великий Антонио де Бари разделил все микроорганизмы на четыре группы: облигатных сапротрофов, факультативных паразитов, факультативных сапротрофов и облигатных паразитов. Очевидно, что объектом фитоиммунологии являются только последние три группы, члены которых могут быть паразитами растений.

С трофической точки зрения фитопатогенные организмы используют одну из трех главных стратегий атаки растения: некротрофию, биотрофию или гемибиотрофию. Некротрофы сначала убивают клетки хозяина, а затем используют их содержимое. Биотрофные патогены вторгаются в живые клетки растения и направляют обмен веществ в сторону поддержки своего собственного роста и репродукции. Гемибиотрофные патогены начинают свое развитие как биотрофы, но убивают окружающие клетки хозяина в течение более поздних стадий инфекции.

Паразитирующие на растениях микроорганизмы имеют различные типы специализации. Самый известный тип специализации имеет отношение к таксонам растений-хозяев, на которых может паразитировать данный фитопатоген. Этот тип специализации можно назвать филогенетической специализацией. На основании этой особенности издавна возбудители болезней растений делят на монофагов, олигофагов и полифагов. Монофаги поражают растения одного вида, одного рода или нескольких близких родов. Олигофаги специализируются в пределах семейства высших растений, и, наконец, полифаги могут поражать растения из разных семейств, порядков и даже классов.

Помимо филогенетической специализации, некоторые фитопатогенные организмы могут развиваться только в определенных тканях или органах растений, то есть имеют тканевую и/или органотропную специализации. Например, возбудитель пузырчатой головни кукурузы поражает только меристематические ткани в разных органах растения; возбудитель рака картофеля поражает столоны и клубни, но не корни.

Специфические фитотоксины.

Специфические токсины по отношению к чувствительным сортам и линиям растений активны при концентрациях в пределах от ~10 pM до 1 μM, и их степени специфики (селективности для хозяина) находятся в диапазоне от 100-кратной до >10⁶-кратной. Несмотря на их название, не все токсины токсичны при всех условиях. HC-токсин, например, не только не убивает неделящиеся протопласты мезофилла листа, но фактически способствует их выживанию.

T-токсин

T-токсин производится изолятамирасы T C. heterostrophus. Раса T C. heterostrophus очень вирулентная для линий кукурузы, обладающих цитоплазматической мужской стерильностью техасского типа (Tcms). Раса 0 C. heterostrophus, которая не производит T-токсин, является второстепенным патогеном кукурузы независимо от цитоплазмы. Исследование относительно C. heterostrophus раса T и ее токсина стимулировались эпидемией Южного гельминтоспориоза кукурузы в 1970, случаем, который сосредоточил внимание на генетической уязвимости главных хлебных злаков. Эта эпидемия произошла из-за все более и более широкого распространения использования Tcms, экономичной альтернативы ручного удаления метелок в производстве гибридов кукурузы в течение 1960-ых. К 1970, большинство гибридных семян, выращенных в Соединенных Штатах, имело Tcms, и в том же году погодные условия были благоприятны для развития Южного гельминтоспориоза кукурузы.

T-токсин активен при ~10 nM у Tcms кукурузы и при ~10 μM у кукурузы с нормальной цитоплазмой. Чувствительны к токсину митохондрии растений. Основа чувствительности к T-токсину – перегруппировка митохондриального генома Tcms растений, которая приводит к синтезу химерного белка URF13, локализованного во внутренней митохондриальной мембране. Физические и биохимические исследования указывают, что URF13 формирует олигомерные поры в мембранах митохондрий в присутствии T-токсина.

Викторин

Викторин был одним из первых обнаруженных HST; он имеет высокую токсичность (эффект был зарегистрирован при 10 pM). C. victoriae (причина увядания овса Виктория) отрицательно воздействовал на экономику Соединенных Штатов в течение 1930-ых, вызывая главные эпидемии овса. Происхождение эпидемии увядания Виктории связано с модификацией генома овса. В 1930-ых, серьезной болезнью овса была корончатая ржавчина, вызванная Puccinia coronata. Обнаруженный в Уругвае ген Pc-2 обеспечивает хорошую устойчивость к P. coronata, и он был внедрен в основные сорта овса в Соединенных Штатах, в первую очередь сорт Виктория. Вскоре появилось ранее неизвестное увядание, которое специфически поражало сорта овса с геном Pc-2. Ген, который обеспечивает восприимчивость к C. victoriae, названный Hv-7 или Vb, является или тем же самым геном, что и Pc-2, или очень сильно связанным.

Как это ни парадоксально, несмотря на длительное изучение, точный механизм действия викторина остается неизвестным. Предполагается, что он связывается с одной из субъединиц декарбоксилазы глицина (GD) – сложного фермента с 42 субъединицами четырех типов. Фермент локализован в митохондриях и играет центральную роль в цикле фотодыхания. Викторин специфически ингибирует GD в растительных тканях, но он не оказывает никакого эффекта на GD в выделенных, неповрежденных митохондриях, из-за отсутствия поглощения. В интактных тканях, викторин накапливается в митохондриях чувствительных клеток, но не в митохондриях устойчивых клеток. Возможно, продукт гена Hv-7 может контролировать поглощение митохондриями или метаболизм викторина.

HC-токсин

Восприимчивость к C. carbonum раса 1 и чувствительность к его токсину, HC-токсину, контролируется двумя генами кукурузы, Hm1 и Hm2. Устойчивая кукуруза имеет ферментативную активность редуктазы HC-токсина, которая детоксифицирует HC-токсин. Эта ферментативная активность также присутствует в экстрактах других трав (овес, пшеница, и ячмень), но не обнаружима в экстрактах нескольких двудольных растений. Основа нечувствительности двудольных к HC-токсину не известна.

HC-токсин ингибирует рост корнякукурузы, но не токсичен для клеток. Он имеет цитостатическую, но не цитотоксическую активность по отношению к клеткам млекопитающих. Современное доказательство указывает, что сайт действия HC-токсина – деацетилаза гистонов (HD), фермент, который обратимо деацетилирует внутренние гистоны (H3 и H4), когда они собраны в хроматине. Ацетилирование и деацетилирование внутренних гистонов изменяют индуцибельность и супрессивность некоторых классов генов, но детали того, как это происходит, не выяснены. HC-токсин ингибирует HD кукурузы, вызывая накопление ацетилированных гистонов in vivo.

В настоящее время исследователи пытаются понять, как ингибирование активности HD способствует заражению кукурузы C. carbonum раса 1. Тогда как другие специфические токсины, типа T-токсина и викторина, ингибируют центральные метаболические процессы в чувствительных тканях, приводя к гибели клеток, процесс ацетилирования/деацетилирования гистонов не является в достаточной степени понятым, чтобы можно было предсказать, почему ингибирование HD должно вызвать восприимчивость к болезни. Исследования с использованием дрожжевых гистоновых мутантов и ингибиторов HD указывают, что вмешательство в ацетилирование гистонов не летально для клеток, но нарушает нормальное развитие эмбрионов и нормальное регулирование генов. Одно возможное объяснение действия HC-токсина – то, что он способствует заражению, интерферируя с индукцией генов защиты кукурузы, то есть препятствует индукции защитных реакций растения.

В заключение следует упомянуть, что специфические фитотоксины не являются попросту метаболическими ядами, убивающими клетки растения. Для проявления их токсического действия необходимо активное участие метаболизма клетки хозяина; например, их токсический эффект не проявляется в случае ингибирования синтеза белка в клетки растения. В последнее время накапливается все больше экспериментальных данных, которые свидетельствуют о том, что гибель клеток растения обусловлена внутренними механизмами и представляет собой фактически защитную реакцию растения ­ – реакцию сверхчувствительности. Если это так, то некротрофные патогены ­– продуценты специфических фитотоксинов – фактически индуцирую реакцию устойчивости, эффективную против биотрофных и некротрофных патогенов, и в дальнейшем используют ее результат к собственной выгоде.

Неспецифические фитотоксины

Неспецифические фитотоксины активны как для растений-хозяев, так и нехозяев. Такая неселективность, очевидно, противоречит роли для токсина в детерминации диапазона растений-хозяев. Тем не менее, эти токсины могут выполнять определенную функцию в течение патогенеза гриба на конкретном хозяине. Альтернативно, они могут интерпретироваться как своего рода рудименты более ранних стадий эволюции гриба в направлении фитопатогенности, активность которых может быть блокирована в большинстве растений детоксификацией или другими механизмами.

Значение неспецифических токсинов грибов в патологическом процессе остается мало понятным. Эти токсины не являются детерминантами патогенности или вирулентности. В то же время возможно, что оно недооценивается. Хотя механизм действия неспецифических токсинов остается в большинстве случаев неизвестным, тем не менее есть данные, что они могут затрагивать фундаментальные процессы метаболизма.

Фитопатогенные бактерии. В отличие от грибов, фитопатогенные бактерии не могут проникать через неповрежденные покровные ткани растений. В то же время большинство бактерий являются достаточно маленьким, чтобы проникнуть через устьица и другие естественные отверстия в апопласт. Тем не менее, на растениях паразитирует удивительно малое число бактерий. Это свидетельствует о потребности в определенных свойствах, которые необходимы для бактерии для того, чтобы стать фитопатогенной.

Большинство фитопатогенных бактерий являются грамотрицательными. Особенности грамположительных бактерий изучены хуже. Фитопатогенные бактерии паразитируют в межклеточных пространствах различных органов расте­ний или в ксилеме. Они раньше или позже вызывают гибель клеток растений, то есть являются некрогенными.

В отношении специализации по видам растений, на которых они паразитируют, можно отметить, что ряд бактерий имеет широкой круг хозяев, в то время как отдельные патовары других бактерий паразитируют на ограниченном числе видов.

Как и фитопатогенные грибы, фитопатогенные бактерии можно разделить на некротрофные и биотрофные. Некротрофными являются, например, Erwinia ca­rotovora E. chrysan­themi, вызывающие мягкие гнили многих растений. Биотрофными являются большинство представителей родов Pseudomonas, Ralstonia и Xanthomonas, а также Erwinia amylovora.

Паразитизм грамотрицательных бактерий зависит от нескольких особенностей. Одна из основных предпосылок – наличие так называемых hrp (гарп) генов. При нарушении функции любого из этих генов бактерии перестают вызывать реакцию сверхчувствительности при заражении растений-нехозяев, а также утрачивают способность к паразитизму на растениях-хозяевах. Иначе говоря, мутанты по генам hrp ведут себя подобно непатогенным бактериям. Таким образом, наличие функциональных генов hrp является обязательным условием для паразитизма фитопатогенных бактерий. Ряд этих генов кодируют компоненты системы секреции белка типа III, которая, по всей видимости, позволяет доставлять бактериальные белки внутрь клеток хозяина.

Однако наличие генов hrp является необходимым, но недостаточным условием для патогенеза на растениях. Например, когда кластеры этих генов внедряли в сапротрофные бактерии P. fluorescens или E. coli, эти бактерии начинали вызывать реакцию сверхчувствительности у многих растений, но не могли вызвать болезнь, то есть не становились фитопатогенными. Для патогенеза на растениях необходимы дополнительные факторы.

Одним из таких факторов являются эффекторы патологического процесса, чаще всего белковой природы. Эти белки доставляются в растительную клетку системой секреции типа III, и несмотря на то, что их функция плохо понятна, считается, что они в частности подавляют защитные реакции растения.

Кроме этого, имеются другие факторы, обуславливающие вирулентность бактерий. К таким факторам относят в частности токсины. Токсины, продуцируемые некрогенными грамотрицательными патогенами (прежде всего патоварами P. syringae) являются вторичными метаболитами (главным образом маленькие пептиды). Они не выявляют никакой специфичности по отношению к хозяину, типично не вносят вклад в размножение бактерий в растениях, легко диффундируют и часто вызывают характерные повреждения. Бактериальные токсины, как полагают, являются факторами вирулентности.

Фактические роли индивидуальных токсинов в патогенезе все еще неясны. Токсины продуцируются некоторыми нефитопатогенными штаммами P. syringae, и многие из них также имеют антибактериальную активность и таким образом могут первично функционировать как факторы конкуренции бактерий в течение эпифитной стадии развития. В некоторых случаях гены, обусловливающие биосинтез токсина, могут быть удалены без влияния на патогенность бактерий. В то же время ряд токсинов, как считают, вносят вклад в патологический процесс, по крайней мере, на ранней стадии.

Еще одним фактором вирулентности являются внеклеточные полисахариды. Внеклеточные полисахариды, в отличие от токсинов, производятся большинством бактерий, включая многих патогенов растений, и секретируются как свободная слизь или как материал капсулы. Они, как полагают, защищают свободноживущие бактерии от разнообразных экологических стрессов и могут способствовать патогенезу, поддерживая насыщение водой межклеточного пространства, снижая доступность бактериальных клеток для антибактериальных соединений, нарушая распространение сигналов, активирующих защиту растений, и блокируя ксилему, таким образом, вызывая симптомы увядания. Исследования мутантов этих бактерий выявило, что внеклеточные полисахариды вообще являются фактором вирулентности, внося вклад в формирование симптомов увядания и водянистости тканей. При этом они не являются абсолютно необходимыми для патогенеза, и не имеют никакой специфичности для хозяина. Следует отметить, что фитопатогенные бактерии, как и все остальные бактерии, в естественных условиях образуют биопленки, и динамика развития биопленок и их свойства во многом связаны с составом внеклеточных полисахаридов. В свою очередь этот состав подвержен изменениям в зависимости от этапов развития биопленки и регулируется в частности таким явлением, как ощущение кворума.

Следующим фактором вирулентности бактерий являются пектиназы. Все деградирующие клеточную стенку ферменты бактерий экспортируются из клеток посредством системы секреции типа II. Бактериальная мягкая гниль, вызываемая некротрофными патогенами E. carotovora, E. chrysanthemi и P. viridiflava, существенно отличается от болезней, вызванных биотрофными патогенами. Эти бактерии имеют широкий диапазон хозяев, особенно среди растений с мясистыми паренхиматическими тканями, степень развития болезни больше зависит от экологических условий, которые ослабляют хозяина. Патогенез определяется пектиновыми ферментами, которые расщепляют α-1,4-галактуронозильные связи в полимерах клеточной стенки растения посредством гидролиза (полигалактуроназы) или β-элиминирования (пектат- или пектинлиазы). Из-за структурной важности и уникальной доступности пектиновых полимеров в первичных клеточных стенках и срединных пластинках двудольных и некоторых однодольных растений, пектиновые ферменты – существенное оружие патогенеза с использованием, так сказать, грубой силы, и они вызывают как гибель клеток, так и мацерацию ткани, то есть первичные признаки мягкой гнили.

Патогенез Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens является фитопатогеном почвы, который генетически трансформирует хозяина, вызывая корончатые галловые опухоли, важную болезнь, которая затрагивает большинство двудольных растений. В природе, эти опухоли обычно формируются на границе воздух-почва, так называемой короне растения. Взаимодействие Agrobacterium –клетка растения – единственный известный природный пример транспорта ДНК между царствами. В этом процессе, ДНК транспортируется из дикого типа Agrobacterium в ядро клетки растения. Экспрессия этой перемещенной ДНК (T-ДНК) имеет результатом неопластический рост (опухоли) на растении-хозяине.

Для трансформации клетки растения требуются три генетических компонента Agrobacterium. Первый компонент – T-ДНК, которая физически транспортируется из бактерии в клетку растения. T-ДНК – дискретный сегмент ДНК, расположенной на 200-kb Ti-плазмиде Agrobacterium; она ограничена двумя 25-bp неполными прямыми повторениями, известными как границы T-ДНК. Второй компонент – 35-kb область вирулентности(vir), также расположенная на Ti плазмиде, которая состоит из семи главных локусов (virA, virB, virC, virD, virE, viG и virH). Белковые продукты этих генов, которые называют белками вирулентности (Vir), отвечают на специфические вещества, секретируемые поврежденным растением, чтобы произвести копию T-ДНК, и опосредуют ее перемещение в клетку хозяина. Третий компонент – набор хромосомных генов вирулентности (chv), расположенных на хромосоме Agrobacterium. Гены chv вовлечены в хемотаксис бактерии и прикрепление к поврежденной клетке растения.

Поскольку элемент T-ДНК определен границами, область кодирования дикого типа T-ДНК может быть заменена любой последовательностью ДНК без какого-либо влияния на ее перемещение из Agrobacterium в растение. Таким образом, Agrobacterium часто используется, чтобы произвести трансгенные растения, экспрессирующие интересующие гены.

Восприятие сигналов поврежденного растения. Поврежденные растения секретируют сок с характерным кислым pH (от 5.0 до 5.8) и высоким содержанием различных фенольных соединений, типа предшественников флавонидов и лигнина. Эти условия специфически стимулируют экспрессию vir генов Agrobacterium. Лучше всего охарактеризованные и самые эффективныеиндукторы генов vir – моноциклические фенольные вещества типа ацетосирингона (AS). Эти молекулы не обнаружены, или обнаружены на низких уровнях, у неповрежденных растений, но их количество значительно увеличивается в поврежденных клетках растений.

Сигналы растения воспринимаются сенсорной двухкомпонентной системой бактерий, которая состоит из мембранной сенсорной киназы и цитоплазматического регуляторного белка. У Agrobacterium имеется двухкомпонентная система трансдукции сигнала, состоящая из белков вирулентности VirA и VirG. Вместе, эти белковые молекулы чувствуют сигнальные молекулы, секретируемые поврежденными клетками растения, и активируют экспрессию других vir генов, таким образом инициируя процесс транспорта T-ДНК. Сенсорным компонентом является белок VirA, являющийся сенсорной киназой. Сигналы растения активируют VirA, после чего эта киназа автофосфорилируется в остатке His-474, а затем фосфатная группа переносится на остаток аспарагина белка VirG. Белок VirG взаимодействует с так называемым vir -боксом, то есть с консервативной последовательностью из 12 нуклеотидов в регионах промотора индуцибельных vir генов на Ti-плазмиде.

Прикрепление Agrobacterium к клеткам растения-хозяина является предпосылкой для передачи ДНК. Распознавание Agrobacterium –клетка хозяина – процесс из двух шагов. На первом шаге, бактерии свободно связывают с поверхностью клетки хозяина, и на втором связанные бактерии синтезируют нити целлюлозы, которые стабилизируют начальное закрепление, приводя к тесной ассоциации между Agrobacterium и клеткой хозяина.

Показано, что каждая клетка растения связывает конечное число бактерий; поэтому считают, что в связывание вовлечены насыщаемые поверхностные рецепторы растения. У животных белок внеклеточного матрикса витронектин функционирует как рецептор для нескольких бактериальных штаммов. Подобные витронектину молекулы, которые были найдены на поверхности клетки многих видов растений, могут обусловить закрепление Agrobacterium на клетке растения. Витронектин человека, так же как антитела против витронектина, блокируют прикрепление Agrobacterium к культивируемым клеткам растения. Далее, штаммы Agrobacterium, которые являются неспособными связать клетки растения из-за мутаций в их хромосомныхлокусах chvB, pscA или att, также выявляют уменьшенное прикрепление к витронектину. Потенциально, подобный витронектину белок (PVN) растений может представить один из рецепторов, ответственных за специфическое взаимодействие между Agrobacterium и клетками растения. Интересно, недавние данные указывают, что PVN связаны с витронектином животных только иммунологически и что никакое подобие последовательности аминокислот не существует между этими белками. В дополнение к PVN, другие белки и углеводы поверхности клетки растения, вероятно, могут быть вовлечены во взаимодействие с Agrobacterium. Однако эти молекулы еще не идентифицированы.

Образование переносимой Т-нити

Индукцияэкспрессии генов vir в конечном счете имеет одним из результатов производство копии T-ДНК, которая является способной к генетическому преобразованию клеток растения. Различные типы Ti-плазмид несут элементы T-ДНК различного состава. Например, T-ДНК в нопалиновой Ti-плазмиде – непрерывный отрезок ~22 kb. Интересно, что T-ДНК как таковая не оказывает никакого влияния на эффективность перемещения. Поэтому неонкогенные («разоруженные») Ti-плазмиды, с большинством внутренних последовательностей T-ДНК, замененных интересующей ДНК, широко используются как векторы для генетической трансформации растений.

Клетки Agrobacterium с индуцированными генами vir производят линейную одноцепочечную копию области T-ДНК, обозначенную как T-цепь. T-цепь обнаруживается приблизительно в одной копии на индуцированную клетку Agrobacterium. Белки VirDl и VirD2 вместе функционируют как эндонуклеаза, которая выполняет сайт - и цепь-специфические разрезы в участке границ T-ДНК. После расщепления, VirD2 ковалентно прикрепляется к 5′ концу T-цепи. Вырезаемая T-цепь удаляется, и результирующий одноцепочечный промежуток восстанавливается, наиболее вероятно обновленным синтезом ДНК.

Есть сильные параллели между метаболизмом T-ДНК и эволюционно родственным процессом бактериальной конъюгации, которая происходит у большинства бактерий, включая Agrobacterium как таковую. Кратко можно сказать, что система вирулентности Agrobacterium, по-видимому, родственна транспортной системе некоторых плазмид. Хотя, конечно, главное функциональное различие состоит в том, что T-цепь направляется не в другую бактерию, а в ядро эукариотической клетки растения-хозяина.

В середине 1990-х годов были получены прямые доказательства, что в клетку растения и в ее ядро перемещается именно одноцепочечная, а не двухцепочечная, ДНК.

Считают, что T-цепь перемещается из бактерии и в клетку растения как комплекс белок–нуклеиновая кислота. Это промежуточное звено транспорта T-ДНК, названное как T-комплекс, состоит, по крайней мере, из трех компонентов, а именно, из самой молекулы ДНК T-цепи, а также связанных с нею белков VirD2 и VirE2, которые защищают T-цепь, формируют ее в передаваемый (тонкой и развернутый) форме и снабжают специфические сигналы нацеливания. Как было сказано, после разрезания ДНК Ti-плазмиды при посредстве белков VirDl и VirD2, которые вместе действуют как эндонуклеаза, одна молекула белка VirD2 ковалентно присоединена к каждой T-цепи. Также ассоциированным с T-цепью является белок VirE2, который имеет свойство связывать одноцепочечную ДНК. Связывание VirE2 с одноцепочечной ДНК in vitro является сильным и кооперативным, что приводит к формированию очень устойчивых развернутых комплексов VirE2-ssDNA, которые являются в значительной степени устойчивыми к внешней нуклеолитической активности. На основании данных электронной микроскопии и кинетики связывания белка VirE2 in vitro предполагается, что нопалин-специфические T-комплексы имеют 3600 nm в длину и 2 nm в ширину. Они содержат ~ 600 молекул VirE2 и одну молекулы VirD2 и имеют предсказанную молекулярную массу 50 000 kD.

Укрепление клеточных стенок

Микробы должны преодолеть кутикулу растения и/или клеточную стенку для того, чтобы достигнуть клетки, хотя проникновение может иногда происходить через повреждения или естественные отверстия. Укрепление клеточной стенки растения может повысить устойчивость несколькими путями. Для внеклеточных биотрофов, таких как Pseudomonas syringae или Cladosporium fulvum, уплотнение клеточных стенок может затруднять утечку цитоплазматического содержимого, таким образом снижая доступность питательных веществ для патогена. Для некротрофов, таких как Botrytis cinerea, которые зависят от гидролиза клеточных стенок растения для продвижения растущих гиф, диффузия токсинов и ферментов к чувствительным клеткам растений будет замедлена. Кроме того, низкомолекулярные фенольные предшественники лигнина и свободные радикалы, образующиеся в течение реакций полимеризации в клеточных стенках растений, могут нарушать пластичность мембран патогена или инактивировать токсины и ферменты. Сами гифы также могут стать лигнифицированными. Для гаусториальных биотрофов, предотвращение входа гриба в клетку растения будет предотвращать паразитизм.

Одним из типов укрепления стенки, который быстро протекает в ответ на внедрение гриба, является формирование папилл. Папиллы часто образуются под гифой проникновения и являются гетерогенными по составу; они, как считается, физически блокируют проникновение гриба в клетку хозяина.

Быстрое отложение каллозы в клеточных стенках также часто ассоциировано с сайтом несовместимости с патогенном. Блокировка плазмодесм каллозой является существенным компонентом защиты, необходимым для задержки движения вирусов из клетки в клетку.

Основные обогащенные гидроксипролином белки, как считают, играют ключевую роль в организации архитектуры первичной клеточной стенки и могут действовать как очаги инициации полимеризации лигнина. Быстрое окислительное поперечное сшивание сформированных заранее HRGPs через или меж- или внутримолекулярные изодитирозиновые связи может представлять один из наиболее ранних защитных откликов, сопровождающих окислительную вспышку.

Дополнительным, но вероятно более слабым механизмом, который помогает становиться клеточным стенкам более непроницаемыми, является локальное повышение в них содержания лигнина.

Синтез фитоалексинов

Честь открытия фитоалексинов (ФА) принадлежит немецким фитопатологам Мюллеру и Боргеру. Долгое время ФА рассматривались как главный механизм устойчивос­ти растений. Однако в настоящий период помимо ФА в растениях обнару­жены и другие иммунные ответы. Конечно, ФА не утеряли свою значимость, одна­ко их уже следует рассматривать на фоне мультикомпонентного ответа растительной клетки.

К настоящему времени охарактеризовано около 350 ФА у растений из 30 семейств. Их большая часть принадлежит к семейству бобовых (около 130 ФА). Основное число ФА выделено из двудольных растений, но охарактеризованы и некоторые ФА однодольных, в частности у риса, ку­курузы, сорго, ячменя, овса, пшеницы, лука и лилий. ФА изолированы из листьев, стеблей, корней и плодов растений, хотя они не всегда пред­ставлены во всех органах. ФА являются липофильными соединениями, ло­кализованными вокруг места инфекции. Из-за разнообразия их структуры трудно судить о единых механизмах их антимикробной ак­тивности.

Фенилпропаноидные ФА приурочены к растениям семейства бобовых, пасленовых, вьюнковых, зонтичных и злаковых. Известна некоторая струк­турная специфичность ФА, отражающая таксономическое положение их продуцентов. Так, изофлавоноидные ФА, в основном, сосредоточены в растениях семейства бобовых, но их нет у пасленовых, и наоборот, сесквитерпеноидные ФА присущи пасленовым, но не обнаруживаются у бо­бовых.

Образование ФА тесно связано с реакцией СВЧ. Мертвые (некротизированные) клетки, образующиеся в ре­зультате реакции СВЧ, играют особую функциональную роль в явлении ус­тойчивости, поскольку они являются резервуарами для накопления ФА. Сами по себе мертвые клетки вряд ли могут остановить развитие патогена, но они являются местом складирования или вместилища ФА. Поэтому, что­бы судить о защитной роли ФА в качестве антигрибного барьера на пути распространения инфекции, надо рассчитывать их количество не на едини­цу веса инфицированной ткани, где присутствуют как живые, так и погиб­шие клетки, а на их концентрацию в некротизированных клетках. В таких клетках ФА накапливаются в чрезвычайно высоких антигрибных кон­центрациях, которые вряд ли могут выдержать живые растительные клетки.

Что заставляет перемещаться ФА из живых клеток, где они или их близ­кие предшественники образуются, в мёртвые, некротизированные, где они накапливаются, не известно. Возможно, накопление ФА в некротизирован­ных клетках определяется еще и тем, что системы деградации ФА в таких клетках подавлены. Иными словами присутствие ФА в мертвых клетках как бы саморегулируется, поскольку ФА в некрозе инактивируют систему их собственной деградаций, тем самым, способствуя их накоплению.

ФА являются достаточно слабыми антигрибными агентами. Доказательств их пере­движения в растениях не существует. Однако скорость накопления ФА и их локализация в месте инфекции способствует поддержанию в растении токсичной для грибов концентрации. Исход взаимоотношений растения и паразита зависит от двух факторов: от количества образовавшегося ФА и от чувствительности к нему патогена.

Хотя большинство растений продуцируют ФА, существуют виды (огурцы, дыни и арбузы), образование ФА в которых не установлено, хотя есть все основания предполагать их присутствие.

Синтез салициловой кислоты (SA) и бензойной кислоты (BA)

Несовместимые патогены, грибы ли, вирусы или бактерии, часто вызывают накопление как свободных BA и SA, так и их соответственных гликозидных конъюгатов, с наивысшими концентрациями, формирующимися в непосредственной близости к сайту инфекции. Индукция этих веществ обычно ассоциирована с HR. Биохимические пути, приводящие к биосинтезу SA в течение защитного отклика, сейчас относительно хорошо установлены, но их регуляция может различаться между видами растений. SA происходит из фенилпропаноидного пути, но, как представляется (по крайней мере в табаке), синтез SA не регулируется на уровне транскрипции PAL. Вместо этого, высвобождение BA из предсуществующих BA конъюгатов индуцирует растворимую цитохром Р450 монооксигеназу (BA2-H), которая превращает BA в SA. Активность фермента BA2-H сильно индуцируется перед проявлением HR. Однако, у Arabidopsis и других видов, предсуществующие конъюгаты BA могут отсутствовать. В этих случаях, увеличение уровней SA требует увеличения активности PAL. Интересно, что окислительный стресс, вызванный озоном или ультрафиолетом, также запускает биосинтез SA в табаке, возможно посредством химического высвобождения BA из конъюгативных форм.

Неясно, является ли биосинтез SA причиной или следствием HR. Обе гипотезы могут быть правильными. Например, при высоких концентрациях, SA, как сообщают, ингибирует активность каталазы. Это может усилить окислительный стресс, имея результатом увеличение синтеза ROS. Более того, взаимодействия между SA и каталазой и/или аскорбатпероксидазой может привести к повреждающему свободному радикалу SA. Поскольку SA отдает электрон соединению I каталазы, она превращается в окисленную форму, SA^·. Этот свободный радикал SA может инициировать перекисное окисление липидов и может также модифицировать другие макромолекулы.

Были предположены также некоторый другие роли для SA и/или BA в защите растений. Оба вещества могут оказывать непосредственное антимикробное действие. Далее, применение экзогенной SA индуцировало координированную экспрессию PR генов у мног