Тема. Іонний обмін. Хроматографія.

 

2. ОБГРУНТУВАННЯ ТЕМИ. Хроматографія як фізико-хімічний метод аналізу широко застосовується в науковій та лабораторній практиці. Методами хроматографічного аналізу розділяють та ідентифікують амінокислоти, білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди та інші біоорганічні сполуки; вони застосовуються для визначення складу промислових газоподібних і рідких викидів. У комплексі з іншими методами фізико-хімічного аналізу хроматографія є найважливішим методом дослідження в біології, медицині та фармації, методом екологічного контролю та моніторингу.

 

3. МЕТА. Сформувати уявлення про види, особливості та можливості хроматографії, напрямки її застосування у біохімічному, лабораторному, санітарно-гігієнічному аналізі. Набути практичних навичок у проведенні розподільної паперової хроматографії та адсорбційної хроматографії на твердому адсорбенті.

Студент повинен знати:

- суть хроматографічного аналізу;

- класифікацію хроматографічних методів за типом фізико-хімічного

процесу;

- основні види хроматографії за технікою виконання;

- можливості застосування хроматографії у біології, медицині, екології;

вміти:

- проводити якісну колоночну адсорбційну хроматографію;

оволодіти навичками:

- розділення та якісного визначення речовин методом розподільної

паперової хроматографії.

 

ОСНОВНІ БАЗОВІ ЗНАННЯ, ВМІННЯ ТА НАВИЧКИ,

НЕОБХІДНІ ДЛЯ ЗАСВОЄННЯ ТЕМИ.

1) Поняття про гідрофільність (полярність) і гідрофобність (неполярність) сполук.

2) Поняття про адсорбцію, розподіл речовин між двома фазами, що не змішуються.

3) Поняття про гетерогенну рівновагу на межі поділу фаз.

(Матеріал попередніх занять з хімії).

 

ГРАФ ЛОГІЧНОЇ СТРУКТУРИ.

 

Х р о м а т о г р а ф і я

 

Класифікація хроматографічних методів Застосування хроматогра-

за типом фізико-хімічного процесу та фії у біології, медицині,

за технікою виконання фармації та екології

 

Розподільна паперова Адсорбційна колонкова хроматографія

хроматографія амінокислот на твердому адсорбенті

 

ОРІЄНТОВНА КАРТКА ДЛЯ САМОПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ

(самостійна позааудиторна робота студентів)

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Суть хроматографічного методу аналізу.	1.1. Розділення сумішей та ідентифікація компонентів. Якісний та кількісний аналіз.
2. Класифікація хроматографічних методів за типом фізико-хімічного процесу, на якому вони базуються.	2.1. Адсорбційна хроматографія. 2.2. Розподільна хроматографія. 2.3. Йонообмінна хроматографія. 2.4. Осадова хроматографія. 2.5. Гель-фільтрація.
3. Види хроматографічного аналізу за технікою виконання.	3.1. Газова та газо-рідинна хроматографія. 3.2. Паперова та тонкошарова хроматографія. 3.3. Колоночна хроматографія.
4. Можливості застосування хроматографії у біології, медицині, фармації, екології.
5. Методика розділення амінокислот за допомогою розподільної паперової хроматографії.

 

ПИТАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОГО ОПРАЦЮВАННЯ

(самостійна позааудиторна робота студентів).

 

1) Вибрати процеси, що лежать в основі хроматографічних методів дослідження:

1 – йонний обмін, 2 – розчинення у воді, 3 – адсорбція,

4 – випаровування, 5 – кристалізація, 6 – розподіл між двома фазами.

а) 1, 3, 4; б) 2, 3, 4, 6; в) 1, 3, 6; г) 2, 4, 5.

 

2) Вибрати методи хроматографічного аналізу, що базуються на розподілі компонентів суміші між двома рідкими фазами:

1 – газоадсорбційна хроматографія, 2 – паперова хроматографія,

3 – гель-хроматографія, 4 – адсорбційна колонкова хроматографія,

5 – тонкошарова хроматографія, 6 – йонообмінна хроматографія.

а) 2, 5; б) 4, 6; в) 1, 3; г) 1, 2.

 

3) Вказати, яка речовина є нерухомою фазою у паперовій хроматографії.

а) органічний розчинник; б) вода; в) целюлоза;

г) у паперовій хроматографії нерухомої фази немає.

 

4) Вказати параметри паперової хроматографії, які треба стандартизувати при точному визначенні факторів утримування компонентів суміші, що розділяється:

1-температура, 2-тиск, 3-кількість рухомої фази, 4-вид паперу, 5-розмір і форма паперу, 6-вид розчинника.

а) 3,5; б) 4,6; в) 1,3; г) 2,4.

 

5) Вказати, що характеризує величина фактору утримування у паперовій хроматографії.

а) відношення розчинностей компонентів у розчиннику;

б) відношення розчинностей компонентів у нерухомій фазі;

в) відношення швидкостей руху компонентів суміші;

г) відношення швидкостей руху компонента і розчинника.

 

6) Вказати вид хроматографії, що має спільний механізм дії з методом одержання прісної або демінералізованої води.

а) адсорбційна; б) розподільна; в) йонообмінна; г) осадова.

 

ПРАВИЛЬНІ ВІДПОВІДІ.

1) Правильна відповідь в).

Розчинення, випаровування та кристалізація не належать до процесів, на яких грунтується хроматографія.

 

2) Правильна відповідь а).

З наведених видів хроматографії тільки у паперовій та тонкошаровій компоненти суміші розподіляються між нерухомою фазою та розчинником (рухома фаза), який поступово рухається від стартової точки до краю паперу. Нерухомою фазою у паперовій хроматографії є волога фільтру, а у тонкошаровій хроматографії – рідина, якою попередньо просочують шар адсорбента.

 

3) Правильна відповідь б).

Вода, точніше волога паперу, є нерухомою фазою у паперовій хроматографії. Спеціальний хроматографічний папір містить більше 20% вологи.

 

4) Правильна відповідь б).

Від виду паперу (а не його розмірів і форми), виду розчинника залежать значення факторів утримування даних компонентів. Тиск і кількість розчинника, який завжди береться у надлишку для даних розмірів паперу, на значення факторів утримування не впливають. Температура теж не стандартизується, а береться трохи вищою за кімнатну.

 

5) Правильна відповідь г).

 

6) Правильна відповідь в).

Йонообмінна хроматографія, як і одержання демінералізованої або прісної води, базується на йонному обміні між йонами рідкої фази (води, розчину) та рухливими йонами йонообмінної смоли. У йонообмінній хроматографії застосовуються переважно або катіоніт (обмінюється катіонами) або аніоніт (обмінюється аніонами), а при одержанні демінералізованої води її пропускають послідовно через катіоніт і аніоніт, замінюючи катіони й аніони, що містяться у воді, на катіони Н⁺ та аніони ОН^-.

 

ВКАЗІВКИ ДО РОБОТИ СТУДЕНТІВ НА ЗАНЯТТІ.

 

8.1. Проведення адсорбційної хроматографії катіонів на оксиді алюмінію

Розділення катіонів Fe³⁺ та Сu²⁺ проводять за допомогою адсорбційної колоночної хроматографії. Підготувати колонку для хроматографії таким чином: взяти суху скляну трубку довжиною 12 – 15 см із внутрішнім діаметром біля 1 см, що має відтягнутий вузький кінець.

У цей кінець заштовхати трохи вати, а потім заповнити трубку порошком оксиду алюмінію на 4 – 5 см по висоті, періодично постукуючи по трубці, запобігаючи утворенню порожнеч. Підготовлену колонку вертикально закріпити у штативі. Відібрати приблизно по 3 см³ розчинів хлориду феруму(III) і сульфату купруму з однаковою молярною концентрацією еквівалента та змішати ці розчини у пробірці. Одержаний розчин обережно перелити у колонку. Знизу підставити пусту колбочку.

Через деякій час верхній шар адсорбента забарвиться у жовтий колір (катіони Fe³⁺), а нижче утвориться блакитний шар (катіони Сu²⁺).

Після того, як через адсорбент пройде весь розчин, для більшої наочності досліду, треба промити адсорбент невеликою кількістю води, а потім пропустити через колонку проявлювач – розведений розчин жовтої кров¢яної солі K₄[Fe(CN)₆]. Тоді верхній шар забарвиться у темно- синій колір, а шар катіонів купруму – у коричневий.

Зробити висновок про залежність адсорбції катіонів на оксиді алюмінію від заряду катіону. Колонку із забарвленими шарами катіонів намалювати у протоколі роботи.

8.2. Проведення розподільної хроматографії амінокислот на папері.

Готовий фільтр або коло фільтровального паперу діаметром 12 см розкреслити олівцем на 4 сектори: у трьох секторах на відстані 0,5 см від центру олівцем намітити місця старту, а у четвертому секторі вирізати вузький язичок, що доходить майже до центру (рис.3.3). З краю фільтра у трьох секторах зробити позначки: “гл” - гліцин, “сум” - суміш амінокислот, “лей” - лейцин.

 

Гл Сум

Фронт

розчинника

Лейцин

. Гліцин

Лей

л Місце старту

Рис.3.3. Рис.3.4.

 

Потім на місця старту нанести краплі відповідних розчинів: гліцину, лейцину та суміші цих амінокислот. Краплі не повинні бути більшими, ніж 3-4 мм у діаметрі. Нанести по 3-4 краплі поступово, підсушуючи попередню пляму перед нанесенням наступної краплі.

У чашку Петрі налити розчинник, покласти фільтр таким чином, щоб відігнутий язичок був занурений у розчинник. Зверху папір накрити другою чашкою Петрі та поставити у термостат з температурою 45-50⁰С. Коли розчинник дійде майже до краю фільтра, вийняти папір, підсушити його у сушильній шафі та обробити проявником – розчином нінгідрину. Хроматограму підсушити у термостаті – на ній проявляться кольорові плями амінокислот.

За допомогою хроматограми визначити фактори утримування амінокислот гліцину та лейцину. Лінійкою відміряти відстань від місця старту до середини плями кожної з амінокислот та від місця старту до лінії фронту розчинника (рис. 3.4.).

Розрахувати фактори утримування (R_f) амінокислот за формулами: R_{f(гліцину)} = r₁/r_p, R_{f(лейцину)} = r₂/r_p,

 

Де: r₁ – відстань від точки старту до середини плями гліцину, см;

r₂ – відстань від точки старту до середини плями лейцину, см; r_p – відстань від точки старту до лінії фронту розчинника, см.

Замалювати хроматограму, записати результати розрахунків та на їх основі зробити висновок про розподіл амінокислот у залежності від полярності молекул.

 

8.3. Оформлення протоколу лабораторної роботи.

Намалювати у зошиті колонку із забарвленими шарами катіонів. Записати висновок про залежність адсорбції катіонів на оксиді алюмінію від заряду катіону.

Замалювати хроматограму, записати результати розрахунків та висновок про розподіл амінокислот у залежності від полярності молекул.

ЛІТЕРАТУРА.

1. Мороз А.С., Луцевич Д.Д., Яворська Л.П. Медична хімія. –В: НОВА КНИГА, 2006, с.594-601.

2. Медицинская химия: учеб. / В.А. Калибабчук, Л.И. Грищенко, В.И. Галинская и др.; под ред. В.А. Калибабчук. – К.: Медицина, 2008.

3. Садовничая Л.П., Хухрянский В.Г., Цыганенко А.Я.

Биофизическая химия. -Київ: Вища школа, 1986.-С.183 - 186.

4. Равич-Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная химия.

-М.: Высшая школа, 1975. –С. 168 - 174.

 

ЗАНЯТТЯ № 8