Мал. 4. Типова хроматограма. Мал. 5. Хроматограма розділення

Двокомпонентної суміші

Величину R_f використовують для ідентифікації речовин. Ідентичність визначають одночасним хроматографуванням на одному аркуші папе­ру досліджуваного і автентичного зразка тієї самої речовини. Якщо зраз­ки ідентичні, відповідні їм плями на хроматограмах мають однаковий вигляд і ті самі значення R_f(мал. 5).

Кількісне визначення полягає у тому, що пляму вирізають і після подрібнення паперу екстрагують досліджувану речовину відповідним розчинником. Вміст речовини визначають будь-яким методом, придат­ним для визначення малих кількостей (спектрофотометрія, полярогра­фія тощо).

Тонкошарова хроматографія (ТШХ). У цьому методі роль но­сія виконує тонкий шар порошкоподібного сорбенту, нанесений на скля­ну або металеву пластинку. Як сорбенти застосовують силікагель, алюміній оксид, магній силікат тощо.

Аналіз цим методом в цілому мало чим відрізняється від паперової хроматографії. У той же час ТШХ має перед нею ряд переваг: висока швидкість процесу хроматографування, можливість використання як неру­хомої фази більшого асортименту сорбентів, застосування кислих та луж­них рухомих фаз та обробка хроматограм за підвищених температур.

ПХ та ТШХ займають одне з провідних місць серед методів роз­ділення та аналізу органічних та біоорганічних сполук. Ними можна ви­значити речовини масою 10-20 мкг, тривалість розділення становить кілька хвилин, тому їх часто застосовують як експрес-методи.

Методичні рекомендації

1. При вивченні першого питання звернути увагу на ознаки, за якими класифікують хроматографічні методи.
2. Опрацьовуючи друге питання, розглянути малюнки, які ілюструють застосування газової хроматографії.
3. Ознайомившись із третім питанням, скласти схему класифікації методів рідинної хроматографії.
4. При вивченні четвертого питання розглянути переваги паперової та тонкошарової хроматографії.

Запитання для самоперевірки:

1. Наведіть класифікацію хроматографічних методів.
2. Як проводять ідентифікацію компонентів суміші газовою хроматографією?
3. У чому полягає метод визначення кількісного складу суміші газовою хроматографією?
4. На чому ґрунтується гель – фільтраційна хроматографія?
5. Яку величину використовують для ідентифікації речовини у паперовій та тонкошаровій хроматографії?

Тести для самоконтролю

І рівень

1. Вказати метод хроматографії, який належить до рідинної:

а) паперова; б) афінна; в) тонкошарова; г) газова.

2. За формою проведення процесу розрізняють...

а) колонкову; б) капілярну; в) паперову; г) хемосорбційну хроматографію.

3. Паперову хроматографію поділяють на:

а)афінну; б) розподільну; в) адсорбційну; г) капілярну.

ІІ рівень

4.Як експрес – методи використовують:

а) молекулярно – ситову; б) паперову; в) осадову; г) тонкошарову хроматографії.

5. Хроматографічний метод базується на дослідженні сумішей за допомогою:

а) сорбційних процесів; б) осмотичного тиску; в) різниці потенціалів; г) різниці температур.

ІІІ рівень

1. У паперовій хроматографії як нерухому фазу використовують:

а) газову колонку; б) скляну пластинку; в) хроматографічний папір; г) металеву пластинку.

1. Молекулярно – ситову хроматографію використовують для:

а) виділення і очищення полімерів; б) визначення молекулярної маси білка; в) визначення рівня холестерину в крові.

Позааудиторна самостійна робота № 14

Тема: Проведення електрофорезу в дослідницькій та клініко –

Діагностичній лабораторії. Електрофореграми

План

1. Поняття про електрокінетичні явища, їх класифікація.
2. Причини виникнення електрофорезу та методика його проведення.
3. Застосування електрофорезу в біології та медицині.

Час виконання: 2 години

Мета роботи: ознайомитися із застосуванням електрофорезу з дослідницькою та діагностичною метою

Електрокінетичними називають явища, які грунтуються на взаємозв'язку між електричними та кінетичними властивостями дисперсних систем. Вони полягають у тому, що складові дисперсної системи (дисперсна фаза або дисперсійне середовище) рухаються в електричному полі, або, навпаки, виникає різниця потенціалів під час переміщення частинок або рідини.

Усі електрокінетичні явища пов'язані з існуванням на межі поділу фаз подвійного електричного шару. Їх класифікують таким чином.

1. Електрокінетичні явища першого роду, які пов'язані з пере­міщенням в електричному полі складових дисперсної системи (диспер­сної фази або дисперсійного середовища).До них належать: а) елект­рофорез;б) електроосмос.

2. Електрокінетичні явища другого роду, які пов'язані з виник­ненням різниці потенціалів під час переміщення частинок твердої фази (потенціал седиментації або осідання) або рідкого дисперсійного середовища (потенціал течії або перебігу). Це процеси, обернені до електрофорезу та електроосмосу.

Швидкість руху частинок в електричному полі залежить від вели­чини їх заряду. Тому наведені вище електрокінетичні явища дають змо­гу виміряти величину -потенціалу.

Наявність електричного заряду у частинок дисперсних систем і електрокінетичні явища були вперше виявлені професором Московсько­го університету Ф. Рейссом 1808 року.

Електрофорез - це спрямоване переміщення частинок дисперсної фази у постійному електричному полі віднос­но нерухомого дисперсійного середовища. Вивчаючи електроліз води, Ф. Рейсс пропускав постійний електричний струм у приладі, який скла­дався з двох скляних трубок, заповнених водою, занурених у шар воло­гої глини (мал. 6 а).

а б

Мал. 6.Схема досліду Рейсса з електрофорезу (а) і рух частинок під час електрофорезу (б)

При цьому він спостерігав помутніння рідини в трубці з позитивним електродом, очевидно за рахунок переміщення негативно заряджених частинок дисперсної фази (глини) до анода. Таке явище було назване електрофорезом.

Рухливість частинок в електричному полі зумовлена тим, що за умови накладання зовнішньої різниці потенціалів розривається ПЕШ на межі "ковзання", в результаті чого частинка набуває певного заряду і рухається до електрода, знак заряду якого протилежний до заряду час­тинки. При цьому протиіони дифузного шару переміщуються до проти­лежно зарядженого електрода (мал. 6, б).

Швидкість руху частинок дисперсної фази пропорційна величині їх електрокінетичного потенціалу. Тому, спостерігаючи електрофоретич­ний рух частинок, можна визначити знак заряду частинок дисперсної фази і величину потенціалу.

Методика проведення електрофорезу. Експериментально електрофорез проводять у приладі, який є U-подібною градуйованою трубкою з боковим відростком (мал. 7.).

Мал. 7. Схема приладу для проведення електрофорезу:

1 -U-подібна трубка; 2 - кран; 3 - гумовий шланг; 4 скляна лійка

Спочатку в посудину 1 наливають ультрафільтрат допоміжного золю (проміжну рідину) (приблизно 1/3 посудини). Закривають кран 2 і у лійку 4 наливають досліджуваний золь. Обережно відкриваючи кран, випус­кають забарвлений золь, який займає нижню частину приладу, витісня­ючи проміжну рідину вверх. Після занурення електродів у рідину кран закривають, вмикають струм і слідкують за переміщенням границі золю S(S =h₂ –h₁) за певний проміжок часу. Залежно від заряду колоїдних частинок межа золю піднімається до катода чи анода. Обчислюють величину -потенціалу за наведеною вище формулою.

Застосування електрофорезу у медичних дослідженнях.

Клітини організму мають різний за величиною заряд, причому кожен тип клітин звичайно характеризується певним, досить стабільним зна­ченням потенціалу. Жива протоплазматична поверхня та всі біологічні поверхні мають негативний заряд. Зокрема, у різних ссавців при рН = 7,4 величина -потенціалу еритроцитів коливається в межах від -7 до -22 мВ. У людини ця величина дорівнює-16,3 мВ.

Низьке значення ізоелектричної точки еритроцитів (рН_іет = 1,7), а також їх постійний негативний заряд можна пояснити йонізацією кислот­них груп фосфоліпідів на поверхні еритроцитів. Лейкоцити, як і еритроци­ти, рухаються до анода; їх негативний заряд зумовлений дисоціацією йоногенних груп білків сироватки крові, які адсорбуються на поверхні лейкоцитів.

За електрофоретичною рухливістю клітини крові можна розмісти­ти у такій послідовності: гранулоцити 0,6 ·10^-12 м²/ (с·В); лімфоцити 0,8 ·10-¹² м²/(с·В); еритроцити 1·10^-12 м²/(с·В).

Впровадження електрофорезу у біохімічні дослідження дало змо­гу розділити складні суміші біологічних рідин і дослідити їх індивіду­альні характеристики, зокрема склад білків сироватки крові та шлунко­вого соку. Серед біологічних рідин найкраще досліджена і викликає най­більший інтерес кров (таблиця 3).