Позааудиторна самостійна робота № 13

Тема: Хроматографія та її застосування в біології та

Медицині

План

1. Поняття про хроматографічні методи та їх класифікація.

2. Метод газової хроматографії та його застосування в біології та медицині.

3. Класифікація рідинної хроматографії та її застосування.

4. Паперова та тонкошарова хроматографії, їх переваги.

Час виконання: 3 години.

Мета роботи: ознайомитися із принципами та застосуванням хроматографічних методів у біології та медицині.

Серед великої кількості хімічних та фізико-хімічних методів розді­лення, аналізу, дослідження структури і властивостей індивідуальних хімічних сполук та їх складних сумішей одне з провідних місць займає хроматографія.

Цей метод був відкритий у 1903 році М. Цвєтом, який вперше за­стосував його для розділення рослинних пігментів.

У наш час хроматографію широко використовують у наукових дослідженнях та в практиці контрольно-аналітичних, клінічних та хіміко-токсикологічних лабораторій.

Класифікація хроматографічних методів

Хроматографія - це фізико-хімічний метод розділення і аналізу сумішей газів, випарів, рідин або розчинених речовин за допомогою сорбційних процесів. Метод ґрунтується на різному розподілі ком­понентів суміші між двома фазами - рухомою та нерухомою.

Речовини, що складають нерухому фазу, називають сорбентами. Вони можуть бути як у твердому, так і рідкому стані, але переважно це тверді речовини. Як сорбенти використовують силіцій діоксид, силіка­гель, алюміній оксид тощо.

Рухома фаза - це потік рідини або газу, що фільтрується крізь шар сорбенту. Вона виконує функції розчинника і носія суміші речовин, які аналізують, і її називають сорбатом.

Хроматографічні методи поділяють за такими ознаками:

- за середовищем, в якому проводиться розділення: газо­рідинна та рідинна хроматографія; газова,

- за механізмом розділення: молекулярна, гель-фільтраційна, йонообмінна, осадова, розподільна хроматографія;

- за формою проведення процесу: колонкова, паперова, тонко­шарова, капілярна хроматографія.

Залежно від способу переміщення досліджуваної суміші вздовж шару сорбенту хроматографічний процес може бути фронтальним, проявниковим та витиснювальним.

Розглянемо найпоширеніші у біології та медицині хроматографічні методи аналізу.

Газова хроматографія

Дня розділення, аналізу і дослідження речовин та їх сумішей, що не розкладаються у газоподібному стані, найбільшого застосування набула газова хроматографія. Залежно від виду сорбенту, яким заповнюють хро­матографічну колонку, її поділяють на газоадсорбційну та газорідинну.

У газовій хроматографії як рухому фазу (газ - носій) найчастіше використовують інертні гази.

Процес розділення і аналізу речовин проводять за допомогою спеці­альних приладів, які називають газовими хроматографами. Незважа­ючи на різні технічні рішення, рівень забезпечення електронними вузла­ми та основні технічні характеристики, принцип будови хроматографів однаковий. У кожному з них є такі основні вузли: система подачі газу-носія, пристрій для введення досліджуваної суміші, хроматографічна колонка, аналізатор (детектор), прилад для реєстрації та аналізу. Залеж­но від виду сорбенту, яким заповнюють хроматографічну колонку, реа­лізується газоадсорбційний або газорідинний варіант хроматографії.

При проходженні досліджуваної суміші крізь хроматографічну ко­лонку її компоненти селективно утримуються нерухомою фазою, а потім виходять із колонки і реєструються детектором, сигнали якого автома­тично записуються у вигляді хроматограми (мал.2.).

Мал. 2.Типова газова хроматограма: А, В - піки відповідних компонентів; А і В - час утримування речовин А і Б; h/2-піввисота піка A;

- ширина піка А на його піввисоті

 

Кожному компоненту суміші на хроматограмі відповідає окремий пік. Положення піка визначається величиною часу утримування (т_R), тоб­то часом від початку введення проби до виходу максимального піка, або величиною утримуваного об'єму (V_R), який розраховують за формулою:

V_R = _R ∙ F,

де F- об'ємна швидкість газу-носія.

Ідентифікацію компонентів суміші проводять шляхом зіставлення часу утримування відповідного компонента і еталона - речовини анало­гічної структури. Час утримування є аналітичною характеристикою речовини.

новини. Збіг часу утримування еталона і досліджуваної речовини вка­зує на їх ідентичність.

Визначення кількісного складу суміші полягає у тому, що інтенсивність піка кожного компонента пропорційна його вмісту у суміші. Є різні способи вимірювання площі S піків. Найпростішим методом є множення висоти піка h (рис.24) на його ширину w, виміряну на половині висоти піка

S =h w

Метод газохроматографічного аналізу дуже чутливий. Для його проведення достатньо кілька кубічних сантиметрів газу, мікролітрів ріди­ни чи мікрограмів леткої речовини.

Газова хроматографія знайшла широке застосування у медицині для визначення вмісту багатьох лікарських препаратів, продуктів їх ме­таболізму, рівня жирних кислот, холестерину, стероїдів в організмі хво­рого тощо. Такі аналізи дають важливу інформацію про стан здоров'я людини, перебіг хвороби, ефективність використання тих чи інших ліків. Як приклад, на мал. 3 наведена газорідинна хроматограма гнійних виділень легень хворого, ураженого анаеробною інфекцією, до і після лікування антибіотиком цефалоспорином.

а б

Мал. 3. Хроматограма гною з плевральної порожнини при анаеробному сепсисі до - а і після лікування -б: 1 - ацетатна; 2 - пропіонова; З - масляна;

4 - ізовалеріанова кислоти (за даними К. Н. Зеленіна)

Після двотижневого лікування усі кислоти, за винятком ацетатної, яка є природним метаболітом, зникли. Таким чином, газорідинна хро­матографія стає цінним методом клінічного контролю за перебігом про­цесу лікування.

Газову хроматографію з успіхом застосовують у токсикологічній хімії, судовій медицині, криміналістиці та гігієні.

Рідинна хроматографія. У методі рідинної хроматографії рухомою фазою є рідина, нерухо­мою - твердий адсорбент. На відміну від газової, рідинна хроматогра­фія може бути використана для аналізу речовин з молекулярною масою від кількох сотень до кількох мільйонів а.о.м., включаючи складні мак­ромолекули нуклеїнових кислот, білків тощо.

Залежно від характеру взаємодій, що відбуваються у шарі сорбен­ту, рідинну хроматографію поділяють на дві групи: молекулярну та хемосорбційну.

До першої групи відносять гель-фільтраційну (молекулярно-си­тову), адсорбційно-рідинну і рідинно-рідинну хроматографії з відносно слабкою взаємодією в системі сорбат - сорбент - розчинник.

До другої групи належать йонообмінна, комплексоутворююча, осадова, окисно-відновна і афінна хроматографії - із сильною взає­модією між сорбатом і сорбентом.

Молекулярна рідинна хроматографія. У даному методі довжина колонок значно менша, ніж у газовій хроматографії. Як розчинник застосо­вують легкі вуглеводні та їх похідні: гексан, бензен, толуен, метанол, етанол, ацетатну кислоту тощо. Їх вибір визначається типом сорбенту, яким може бути силікагель, алюміній оксид, магній оксид, сахароза, полімери.

Адсорбційно-рідинний та рідинно-рідинний методи хромато­графії тісно пов'язані між собою. їх застосовують для розділення сумі­шей нуклеотидів, вітамінів, лікарських препаратів та інших складних органічних сполук.

Гель-фільтраційна хроматографія ґрунтується на принципі розді­лення суміші речовин за розмірами їх молекул. Процес відбувається за рахунок того, що в цеоліт (молекулярне сито) або пори гелю дифунду­ють тільки ті речовини, розміри молекул яких не перевищують розміри пор адсорбенту. Внаслідок цього молекули меншого розміру проходять більший шлях і виходять з колонки пізніше, ніж крупніші молекули.

В останній час молекулярно-ситову хроматографію широко вико­ристовують для визначення молекулярної маси білків, виділення та очи­щення біополімерів (білків, пептидів, полісахаридів, нуклеїнових кислот) і навіть для розділення клітин, наприклад, лімфоцитів, еритроцитів тощо.

Хемосорбційна хроматографія. У біології та медицині широко застосовують один з її різновидів - афінну, або біоспецифічну хрома­тографію. В основі цього методу лежить унікальна властивість висо-комолекулярних біологічно-активних сполук "упізнавати" в будь-якій суміші тільки певні ("свої") речовини і взаємодіяти з ними.

Умовно процес розділення речовин за допомогою афінної хрома­тографії можна показати таким чином: колонку заповнюють носієм, міцно зв'язаним з певною біологічно-активною речовиною, яку в даному разі називають лігандом, і пропускають крізь колонку досліджувану суміш речовин, до однієї з яких ліганд виявляє біологічну спорідненість. Він вибирає із суміші цю речовину, утворює з нею комплекс, який залишаєть­ся у колонці, а інші компоненти суміші проходять крізь неї. Підібравши умови, за яких комплекс ліганду з вибраною ним речовиною розкла­дається, її вимивають відповідним буферним розчином.

Паперова та тонкошарова хроматографія. У фармації та медицині широко застосовують паперову та тонко­шарову хроматографії, які відрізняються від інших хроматографіч­них методів простотою і зручністю у виконанні експерименту. Це, у по­єднанні з мікрокількістю досліджуваних речовин, необхідних для аналі­зу, забезпечило їм широке розповсюдження у хімічному аналізі.

Паперову хроматографію (ПХ) поділяють на розподільну, адсорб­ційну та йонообмінну. У ПХ як нерухому фазу використовують хромато­графічний папір або речовини, попередньо нанесені на його волокна. Ме­ханізм хроматографії на папері може бути розподільним або адсорбційним.

Для одержання хроматограми розчини чистих речовин (свідків) і суміші, яку необхідно розділити, наносять на хроматографічний папір, нижній кінець якого занурюють у відповідну систему розчинників. Че­рез деякий час суміш розділяється на зони окремих компонентів. Для виявлення зон хроматограму розглядають в УФ-світлі при певній дов­жині хвилі і відмічають олівцем контури плям. Якщо компоненти дають кольорові реакції, то хроматограму проявляють шляхом її занурення в розчин реактанту або обприскуванням із пульверизатора.

Характеристикою компонентів є величина R _а - відношення відстані від стартової лінії хроматограми до центра плями цієї речовини (l), до відстані, яку пройшов фронт розчинника (L) — R_f = l/L, Типова хроматограма наведена на мал. 4.