Работа 1. Взятие крови у рыб, стабилизация.

Общее количество крови в организме животных составляет приблизительно 4-8% от массы тела. Форменные элементы составляют около 45% объема крови, плазмы – 55%.

Для предотвращения свертывания крови к последней добавляют стабилизаторы, т.е. антикоагулянты. С этой целью используют следующие антикоагулянты (на 10 мл крови):

1. 50 ЕД гепарина медицинского в растворе (в 1 мл раствора 5000 ЕД); 1-2 капли гепарина отмеривают тонкой иглой для внутрикожной туберкулинизации.

2. 3-4 капли 10%-го раствора трилона Б (двунатриевая соль ЭДТА – этилендиаминтетрауксусной кислоты).

3. 30 мг натрия цитрата или 0,3 мл 10%-го раствора.

4. 15 мг натрия (калия) оксалата или 0,15 мл 10%-го раствора.

5. 0,3-0,5 мл 10%-го раствора натрия хлорида.

Чтобы кровь хорошо перемешалась с антикоагулянтом, пробирку закрывают пробкой, 10-15 раз легко переворачивают, не взбалтывая.

Стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре +4⁰С. Для подсчета форменных элементов кровь пригодна в течение 72 часов, для приготовления мазков – не более 24 часов.

Для получения сыворотки периферическую кровь берут в сухие чистые пробирки и ставят в теплое место для свертывания. Образовавшийся сгусток крови отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 5-10 минут при 2-3 тыс. об/мин. Сыворотку отсасывают пипеткой. Для получения плазмы центрифугируют стабилизированную кровь при тех же условиях.

Реагенты: спирт, антикоагулянт

Оборудование: шприц, рыба

Кровь у рыб берут из сердца, луковицы брюшной аорты, подкожной и хвостовой артерии.

Ход работы. Одним из предложенных методов взять кровь у рыбы из:

- сердца (рис. А) – между грудными плавниками с брюшной стороны обработать спиртом место взятия крови с целью удаления слизи, содержащей тромбокиназу, затем просушить салфеткой. Иглу шприца ввести с брюшной стороны по сагиттальной линии в точке между грудными плавниками, направляя иглу к голове;

- подкожной артерии (рис. Б) – у сеголеток пункцию провести в точке пересечения средней боковой линии и линии, идущей перпендикулярно от анального отверстия; у рыб старших возрастов – в точке пересечения боковой линии и перпендикулярной к ней линии, идущей от заднего конца анального плавника.

		А		Б

 

 

А – из сердца (1) рыбы, Б – из подкожной артерии (1 — у сеголетков; 2— у карпов старшего возраста)

Рисунок 1. – Взятие крови у рыб

 

Оформление работы. Зарисуйте схематически места взятия крови у рыб. Запишите возможные к использованию антикоагулянты.

Работа 2. Постановка реакции агглютинации на стекле и в пробирках

Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген, который обладает двумя свойствами: 1) способностью вызывать иммунологический процесс в организме; 2) способностью соединяться с антителами в серологических реакциях.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими (от лат. serum — сыворотка). Серологические реакции используют: 1) для обнаружения в сыворотке крови антител к тому или иному микробу с помощью известного специфического антигена; 2) для установления вида или типа выделенного микроба по его антигенной структуре с помощью диагностической сыворотки, содержащей известные специфические антитела.

Реакция агглютинации (РА) - обнаруживаемое невооруженным глазом склеивание и выпадение в осадок микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами.

Положительный результат реакции агглютинации характеризуется образованием на дне пробирки осадка с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Осадок на дне пробирки, образовавшийся в результате склеивания микробных тел, называется агглютинатом.

Титр сыворотки - последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация

Постановка РА в пробирках (развернутая РА)

Оборудование: 1) пробирки химические и центрифужные; 2) центрифуга на 2-3 тыс. оборотов; 3) пипетки объемом 10 и 5 мл с делениями на 0,1 мл; 4) градуированные цилиндры; 5) штативы с гнездами, 6) термостат, водяная баня.

Реагенты: 1) сыворотка крови, подлежащая исследованию, 0,1—0,2 мл; 2) физиологический раствор; 3) корпускулярный антиген: взвесь живой 20-часовой культуры микробов. Используются культуры только в S-форме (гладкие, блестящие колонии с ровными краями).

Ход работы. Приготовление разведений сыворотки:

Из сыворотки приготовить ряд последовательных разведений, от 1:50— 1:100 до 1:1600— 1:3200. В отдельной пробирке приготовить первое разведение сыворотки 1:50 или 1:100. Для этого пипеткой набрать 0,1 мл сыворотки, другой пипеткой добавить к ней 4,9 мл (1:50) или 9,9 мл (1:100) физиологического раствора. Основной раствор сыворотки используется для приготовления последовательных, двукратных разведений.

По окончании разведений во все пробирки ряда (кроме контрольной) прибавить по 2—3 капли антигена.

Контроль: 1) изотонический раствор хлорида натрия с микробными антигенами, 2) исследуемая сыворотка без антигена.

Пробирки встряхнуть и поставить на 2 часа в термостат при температуре 37 °С.

Через 2 часа подвести предварительный результат реакции – начать учет реакций с контрольных пробирок. Если нет агглютинации в контрольных пробирках и есть хлопья в 2-3 и более пробирках, то говорят о положительной реакции. Окончательный результат реакции агглютинации регистрировать на следующий учебный день (через 18—20 часов стояния пробирок при комнатной температуре). Определить титр сыворотки.

Результат РА охарактеризовать, используя систему четырехкрестового обозначения:

+ + + +— полная агглютинация, при которой большой осадок на дне располагается кучкой или в форме открытого перевернутого зонтика. Надосадочная жидкость прозрачная;

+ + + — почти полная агглютинация, осадок такой же, надосадочная жидкость почти прозрачная;

+ + — слабая агглютинация, осадок едва заметен, жидкость непрозрачная;

+ — отмечаются следы агглютинации;

- — отрицательная реакция, содержимое пробирки равномерно мутное.

Оформление работы. Зарисовать схему постановки опыта, подписать пробирки с разведением, отметить результат реакций.

Постановка РА на стекле (ориентировочная РА)

Оборудование: предметные стекла, лотки, стеклянные мостики, пипетки, бактериальные иглы и петли, спиртовки, лупы.

Реагенты: сыворотка, бактериальная культура на плотной питательной среде, физраствор

Ход работы. На стеклянные мостики над лотками уложить предметные стекла из расчета постановки на каждом стекле по три реакции (в центре и по краям стекла). На поверхность обезжиренного предметного стекла нанести с помощью пипетки по 2 капли агглютинирующей сыворотки каждого разведения (по предыдущей работе). На последнем стекле внести каплю изотонического раствора (контроль).

В сыворотку внести исследуемую бактериальную культуру, снятую с поверхности плотной питательной среды бакиглой или пипеткой. Внесенную культуру перемешать. Через 5—10 мин. при комнатной температуре просмотреть стекла через лупу, записать результат.

При положительной реакция в капле отмечается окучивание бактерий в виде зернышек или хлопьев, при отрицательной – жидкость остается прозрачной.

Оформление работы. Схематически зарисовать постановку опыта, записать результаты.