Работа 4. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева

Оборудование: микроскоп, камера Горяева, пипетка, капилляр от гемометра Сали, пробирка с резиновой крышкой.

Реагенты: жидкость Тюрка (100 мл 5%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего), спирт, иммерсионное масло.

Камера Горяева – толстое предметное стекло с четырьмя желобами в средней части, между которыми находятся три узкие площадки, средняя из которых ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесенные на стекло. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 расчерчены вертикальными и горизонтальными линиями на 16 малых квадратов. Подсчет лейкоцитов ведут в счетной камере Горяева под малым увеличением микроскопа в 100 неразграфленных больших квадратах. Большой квадрат равен 16 малым, что соответствует 100 х 16 = 1600 малым квадратам. Единицей отсчета является маленький квадрат. Его сторона равна 1/20 мм, площадь 1/20*1/20=1/400 мм². Объем крови, помещающейся над маленьким квадратом, равен 1/400 мм²*1/10 мм=1/4000 мм³ (1/10 мм – высота слоя крови). из 225 больших квадратов

Ход работы. Покровное стекло притереть к камере Горяева до появления радужных колец.

Установить увеличение микроскопа в 280 раз (окуляр на 7, объектив на 40). Поставить камеру на предметный столик микроскопа, найти сетки, рассмотреть.

Пипеткой взять 0,4 мл жидкости Тюрка (5%-ый раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим) и влить в пробирку.

Набрать кровь в капилляр от гемометра Сали до отметки (0,02 мл); кончик капилляра вытереть ватой; опустить капилляр в пробирку с жидкостью Тюрка; выдуть кровь в пробирку; промыть капилляр, дважды выдувая этот раствор разбавителя. Пробирку закрыть резиновой пробкой, перемешать содержимое. Набрать содержимое пробирки в капилляр. Каплю из капилляра выпустить на среднюю пластинку под притертое покровное стекло к камере Горяева (пузырьки воздуха не должны попасть под покровное стекло). Оставить на 1 мин., чтобы осели клетки крови.

Подсчитать количество лейкоцитов в 100 больших квадратах (или 1600 малых квадратах). Учитывают клетки, находящиеся внутри каждого малого квадрата, на левых и верхних сторонах каждого квадратика. Не считают на нижних и правых сторонах квадрата, т.к. их число учитывается при подсчете лейкоцитов следующего квадрата.

Рассчитать содержание лейкоцитов в 1 м³ крови. Для этого использовать формулу:

Х=(А*4000*20)/1600, где

А – количество лейкоцитов в 100 больших квадратах,

4000 – коэффициент для приведения объема к 1 мм³ (1/4000 мм³ – объем одного маленького квадрата),

20 – коэффициент разведения крови объемом 0,02 мл,

1600 – количество маленьких квадратов.

Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля (или подсчитанное число клеток крови разделить на 50), ошибка метода составляет ± 7%.

Например, подсчитано 160 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 8 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (система единиц СИ) необходимо результат умножить на 10⁶, т.е. 8 000*10⁶= 9*10⁹/л.

Оформление работы. Записать или зарисовать последовательность счета клеток в камере Горяева. Подсчитать количество клеток, записать.

 

Работа 5. Приготовление мазков крови, окрашивание по Романовскому-Гимзе

Оборудование: обезжиренные предметные и шлифовальные стекла, вата, пинцет, пипетка на 10 мл, глазные пипетки, ванночки размером с предметное стекло, карандаш.

Реагенты: кровь рыбы, 70 % этиловый спирт,

В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. Окрашиватся ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.

Ход работы. Обезжирить предметные стекла

Предметное стекло взять в левую руку между большим и указательным пальцами за короткие грани.

Каплю крови (величиной с зерном пшена) нанести на правый конец стекла (предметным стеклом, углом шлифовального стекла, пипеткой). Капля должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из нее, не доходил на 1 см до края стекла.

Шлифовальное стекло ставят под углом 45º к основному стеклу у правого края предметного стекла, надвигают на каплю крови так, чтобы у нижнего ребра шлифовального стекла равномерно распределилась капля крови. Распределяют справа налево каплю крови по предметному стеклу равномерно, быстро. Мазок должен быть тонким, ровным, желтоватым, просвечивающимся и отливать должен цветами радуги при просмотре на свет.

 

 

 

А – неравномерный мазок на плохо обезжиренном стекле; Б – короткий мазок; В – длинный и неравномерный мазок; Г – толстый в начале мазок; Д – правильный мазок.

Рисунок 2. Качество приготовленного мазка.

 

Высушить мазок быстро (под лампой, в термостате, высоко над спиртовкой).

Промаркировать простым карандашом.

Фиксировать в закрытой кювете в этиловом спирте 5 мин., высушить на воздухе.

На дно ч.Петри налить готовую краску Романовского, препарат уложить мазком вниз в краску, закрыть крышкой от ч.Петри (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). Мазки окрашивать 20 — 25 минут во влажной камере в термостате при 37 °C.

После окрашивания мазки промыть в проточной воде, сушить на воздухе и исследовать при масляной иммерсии.

Оформление работы. Записать последовательность методики окрашивания.