Площади пиков на хроматограммах анализируемого sx и стандартного Sст растворов получились 455 мм2 и 489 мм2 соответственно.

Решение:

m= 455/489* 0,4 мкг/мл*10 мл=3.2719 мкг

 Основные принципы качественного и количественного анализа методом

ГЖХ

Газовая хроматография – процесс разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении компонентов между двумя фазами – газом-носителем (подвижная фаза) и либо твердой фазой, либо жидкостью, нанесенной в виде тонкой пленки на поверхность твердого носителя или стенки хроматографической колонки (жидкая неподвижная, жидкая стационарная фаза).

 В первом случае метод называется газоадсорбционной хроматографией, во втором – газожидкостной (распределительной) хроматографией. Из этих двух вариантов газовой хроматографии наиболее распространена распределительная газожидкостная хроматография – ГЖХ.

Сущность метода ГЖХ состоит в следующем. Анализируемая смесь (обычно – раствор) летучих компонентов переводится в парообразное состояние и смешивается с потоком инертного газа-носителя, образуя с ним подвижную фазу – ПФ. Эта смесь проталкивается далее новой порцией непрерывно подаваемого газа-носителя и попадает в хроматографическую колонку, заполненную неподвижной (стационарной) жидкой фазой – НФ. Разделяемые компоненты распределяются между ПФ и НФ в соответствии с их коэффициентами распределения K, определяемыми формулой:

K = c(НФ) / c(ПФ),

где с(НФ) и с(ПФ) – соответственно содержание (в г/мл) данного компонента в неподвижной и подвижной фазах, находящихся в динамическом равновесии.

Равновесный обмен хроматографируемого вещества между НФ и ПФ осуществляется в результате многократного повторения актов сорбция ↔ десорбция по мере движения ПФ вдоль НФ внутри хроматографической колонки.

Поток газа-носителя увлекает с собой разделяемую парообразную смесь вдоль хроматографической колонки, так что процессы сорбция ↔ десорбция разделяемых компонентов повторяется многократно, причем каждый раз в системе устанавливается динамическое равновесие разделяемых веществ между ПФ и НФ. Эти многократные переходы разделяемых веществ из ПФ в НФ и обратно совершаются по всей длине хроматографической колонки до тех пор, пока пары разделяемых веществ не покинут колонку вместе с газом-носителем.

Поскольку сродство различных разделяемых веществ к НФ различно, то в процессе сорбционных – десорбционных переходов они задерживаются в НФ неодинаковое время. Чем выше температура кипения и относительная растворимость вещества в НФ, т.е. чем больше его коэффициент распределения, тем дольше оно находится в НФ, тем позже покидает хроматографическую колонку. В конце концов из хроматографической колонки вместе с газом-носителем выходят зоны (объемы) парообразных хроматографируемых веществ, разделенных полностью или частично.

Если для двух компонентов смеси коэффициенты распределения одинаковы, то они не разделяются. Если же их коэффициенты распределения различны, то разделение происходит, причем первым покидает колонку тот компонент, у которого коэффициент распределения наименьший.

Пары разделенных компонентов вместе с газом-носителем поступают в детектор хроматографа, генерирующий электрический сигнал – тем больший, чем выше концентрация компонента в парогазовой смеси. Электрический сигнал усиливается и фиксируется регистратором хроматографа в виде хроматограммы, записываемой на диаграммной ленте или на мониторе компьютера (если таковым снабжен хроматограф). Эти хроматограммы и используются для качественной и количественной обработки результатов анализа разделяемой смеси компонентов.

Параметры удерживания.

 Хроматограмма – это зарегистрированная во времени последовательность показаний регистратора. Каждому разделенному компоненту смеси соответствует свой пик на хроматограмме. По оси абсцисс откладывается время (или расстояние), по оси ординат – величина аналитического сигнала, которая тем больше, чем выше содержание данного компонента в разделяемой смеси.

Время удерживания – качественная характеристика каждого компонента;

измеряется от момента ввода пробы до момента выхода максимума (вершины) пика на хроматограмме. Оно зависит от природы хроматографируемого вещества и газа-носителя, скорости прохождения ПФ через хроматографическую колонку, от природы и массы НФ, температуры, длины колонки. Чем выше коэффициент распределения хроматографируемого вещества, тем больше и его время удерживания.Важной характеристикой являются также ширина пиков a(1) и a(2) у их основания и полуширина пиков a(1)1/2 и a(2)1/2, т.е. ширина пиков на середине их высоты для двух разделяемых компонентов 1 и 2.

На практике часто измеряют не время удерживания, а расстояние удерживания l, пропорциональное времени удерживания, т.е. расстояние (например, в мм) на хроматограмме от точки, соответствующей моменту ввода пробы, до абсциссы, отвечающей положению максимума (вершины) пика.

Кроме времени удерживания иногда используют такой параметр, как объем удерживания (удерживаемый объем), равный объему ПФ, который выносит из колонки все данное вещество.

Объем удерживания V зависит от скорости v движения ПФ и равен произведению времени удерживания t на эту скорость:

V = t*v.Коэффициент удерживания (замедления) R– это отношение скорости перемещения w данного компонента вдоль хроматографической колонки к скорости v движения потока газа-носителя:

R = w / v.Коэффициент емкости k равен отношению исправленного времени удерживания t′ = t – to данного компонента к tо: k = (t – to) / to.

Чем выше k, тем большее время находится в НФ данный компонент.

Параметры разделения. Эффективность колонки. К параметрам разделения двух веществ относятся степень и коэффициент разделения. Эффективность хроматографической колонки характеризуется числом теоретических тарелок и величиной, эквивалентной теоретической тарелке.

Степень разделения Rs (разрешение пиков) количественно характеризует

разделение двух пиков на хроматограмме и рассчитывается по формуле:

 

Если Rs < 1, то разделение двух веществ неполное. При Rs > 1 наблюдается полное разделение двух компонентов смеси.

Число теоретических тарелок n. При хроматографическом разделении компонентов смеси осуществляется перенос вещества через границу раздела двух фаз – ПФ и НФ. Чем больше число таких переходов, тем более полно разделяются компоненты смеси. Количество подобных переходов характеризует эффективность хроматографической колонки. Участок зоны внутри колонки, на котором устанавливается равновесное распределение данного вещества между ПФ и НФ (сорбция ↔ десорбция), называют теоретической тарелкой (по аналогии с терминологией, принятой в теории ректификации для ректификационных колонок, в которых осуществляются многократно повторяющиеся акты испарение – конденсация). Разделяемое вещество как бы распределяется по этим тарелкам. Число теоретических тарелок n рассчитывается по формуле n = 5,545 (t / a1/2) 2,

где t – время (или расстояние) удерживания данного компонента смеси, a1/2 – полуширина пика, выраженная в тех же единицах, что и t.

Чем больше число теоретических тарелок n, тем эффективнее работа хроматографической колонки. Число теоретических тарелок может составлять от нескольких сотен до нескольких тысяч. Если длина хроматографической колонки составляет L, а число теоретических тарелок равно n, то величина H, рассчитываемая по формуле H = L / n, называется высота, эквивалентная теоретической тарелке – ВЭТТ. Чем меньше величина ВЭТТ, тем менее размыта зона (полоса) отделяемого компонента при его выходе из колонки.

Параметры H и n характеризуют эффективность хроматографической колонки при разделении компонентов смеси. Чем больше n и меньше H, тем полнее отделение зоны (полосы) данного компонента от зон остальных компонентов при их разделении. Величина ВЭТТ в оптимальном случае часто не превышает ~1,5 мм, хотя может быть и несколько больше

Идентификация разделяемых компонентов проводится преимущественно двумя методами:

 с использованием веществ-свидетелей и времени удерживания.

Метод использования веществ-свидетелей.

В тех же условиях, в которых получают хроматограмму разделяемой смеси, записывают хроматограммы веществ-свидетелей, наличие которых предполагается в анализируемой смеси. Фиксируют время удерживания веществ-свидетелей и сравнивают их с временем удерживания компонентов разделяемой смеси. Совпадение времени удерживания вещества-свидетеля с временем удерживания того или иного компонента на хроматограмме разделяемой смеси может свидетельствовать о том, что данный компонент смеси и вещество-свидетель – идентичны. Иногда вещество-свидетель вносят непосредственно в пробу анализируемой смеси (метод метки). Записывают в одинаковых условиях хроматограммы такой пробы и пробы анализируемой смеси, не содержащей вещества свидетеля. Если число пиков остается одним и тем же, а интенсивность (высота) пика того или иного компонента на хроматограмме возрастает при внесении вещества-свидетеля в пробу, то это означает, что данный компонент и вещество-свидетель – идентичны. Метод относительных удерживаний.

 К анализируемой пробе прибавляют вещество сравнения и хроматографируют смесь строго в тех условиях, которые указаны в методике анализа. Определяют относительное удерживание (относительное время удерживания) согласно формуле:

 

где t, ts, to – время удерживания соответственно определяемого компонента, вещества сравнения и несорбируемого компонента смеси.

 Сравнивают найденное относительное удерживание с указанным в методике.

 

Расчет содержания определяемого вещества.

На практике применяют преимущественно следующие методы расчета содержания определяемых компонентов в хроматографируемых смесях:

абсолютной градуировки (калибровки),

внутренней нормализации,

 внутреннего стандарта,

 внешнего стандарта.

Все методы основаны на измерении параметров пиков на хроматограмме: их площади или высоты. Чаще измеряют площади пиков.

Использование площадей пиков при количественном определении содержания компонентов смеси основано на существовании прямой пропорциональной зависимости между площадью пика данного компонента смеси и его содержанием в хроматографируемой пробе:

S = k m,

где S – площадь пика на хроматограмме, m – масса данного компонента в пробе, k – коэффициент пропорциональности.

Площади пиков на хроматограмме измеряют интегратором хроматографа. Это – наиболее точный метод; ошибка измерения площади пика – меньше 1%.

При отсутствии интегратора площадь пиков рассчитывают, измеряя их высоту и ширину или полуширину. В этом случае погрешности определения площади пиков достигают нескольких процентов.

Принимая приближенно пик на хроматограмме за равнобедренный треугольник, можно рассчитать его площадь S: S = 1/2 h a = h a1/2, где h – высота пика, a – ширина пика у его основания, a1/2 – полуширина пика.

Однако основание пика на хроматограмме обычно несколько размыто, поэтому на практике измеряют не ширину пика a, а его полуширину a1/2. При таком способе рассчитанная площадь пика меньше его действительной площади на несколько процентов.

Метод абсолютной градуировки (калибровки).

 Пусть требуется найти содержание определяемого вещества в анализируемом растворе с использованием площади пика этого вещества на хроматограмме. Готовят серию i эталонных растворов с точно известной концентрацией ci определяемого вещества в каждом растворе. Записывают хроматограммы каждого раствора в одинаковых условиях и измеряют площадь Si пика определяемого вещества на каждой хроматограмме. По полученным данным строят градуировочный (калибровочный) график в координатах Si – ci.

Затем строго в тех же условиях хроматографируют пробу анализируемого раствора с неизвестной концентрацией cx и измеряют площадь Sx пика определяемого вещества.

По градуировочному графику находят концентрацию cx определяемого вещества в анализируемом растворе. Метод предусматривает определение площади только одного пика определяемого вещества. Площади всех остальных пиков (а их на хроматограмме может быть много) не измеряются. Вместе с тем метод требует получения хроматограмм нескольких проб (эталонных и анализируемой) в строго одинаковых условиях.

Метод внутренней нормализации.

 На одной и той же хроматограмме измеряют площади Si всех пиков и определяют их сумму SSi, считая, что элюируются (выходят из колонки) все компоненты анализируемой пробы, так что ни один из компонентов не остается прочно связанным в хроматографической колонке.

Поскольку площадь пика любого компонента прямо пропорциональна массе этого компонента в разделяемой смеси,

то рассчитывают массовую долю Wx в процентах (хроматографический процент) данного компонента X по формуле:

S/сумму площадей* 100%

Метод является одним из самых распространенных. Пики всех разделяемых компонентов получаются на одной и той же хроматограмме, т.е. в идентичных условиях. Однако необходима полная уверенность в том, что с потоком газаносителя элюируются все без исключения компоненты пиков, так чтобы сумма площадей всех пиков соответствовала бы 100%-ому содержанию всех веществ смеси.

Метод внутреннего стандарта.

Готовят несколько (часто – пять) эталонных смесей, каждая из которых включает точно известную массу mi определяемого компонента и массу mст стандарта. В строго одинаковых условиях 201 хроматографируют каждую смесь и на полученных хроматограммах измеряют площади Si пиков определяемого вещества и площадь Sст стандарта.

Площадь пика на хроматограмме прямо пропорциональна массе данного вещества:

Si = k1 mi, Sст = k2 mст.

 

или обратную ему величину 1/k называют поправочным коэффициентом.

Затем к анализируемому раствору, содержащему неизвестную массу mx определяемого вещества, прибавляют точно известную массу стандарта mст и хроматографируют полученный раствор в тех же условиях, что и эталонные растворы, после чего измеряют площади Sx и Sст обоих пиков.

Иногда, наоборот, к раствору стандарта прибавляют определенное количество определяемого вещества. По полученным данным вычисляют отношение Sx / Sст. Окончательную обработку результатов можно проводить либо методом градуировочного графика, либо расчетным путем. В первом случае строят градуировочный график в координатах Si / Sст – mi / mст и затем, зная измеренную величину Sx / Sст, находят по графику отношение mx / mст и массу mx определяемого вещества.

Во втором случае с использованием найденного поправочного коэффициента по формуле рассчитывают отношение

 

 Чем меньше различаются площади Sx и Sст, тем меньше ошибка определения, поэтому анализ обычно проводят в таких условиях, когда площади Sx и Sст – 202 соизмеримы. Пики стандарта и определяемого вещества не должны перекрываться. Метод внешнего стандарта (метод стандарта, метод стандартного образца). Готовят анализируемый раствор, содержащий определяемый компонент, и стандартный раствор, содержащий стандартный образец определяемого вещества в том же растворителе. Концентрацию стандартного раствора стараются подобрать близкой к концентрации определяемого вещества в анализируемом растворе. Последовательно хроматографируют оба раствора в одинаковых условиях и измеряют площади пиков определяемого вещества на обеих хроматограммах. Пусть S и S(ст) – соответственно площадь пика определяемого вещества на хроматограмме анализируемого и стандартного растворов. Тогда: m = k S; m(ст) = k S(ст), где m и m(ст) – соответственно масса определяемого вещества в анализируемом и стандартном растворах; k – коэффициент пропорциональности. После простых преобразований вычисляем m: (ст) S(ст) S m m =; (ст). (ст) m S S m = Зная массу m определяемого вещества в объеме пробы, взятой для хроматографирования, можно рассчитать массу, концентрацию, процентное содержание этого вещества во всем объеме анализируемого раствора. Метод стандартного образца часто используется на практике, однако он требует наличия высокочистого стандартного образца с точно известным содержанием определяемого вещества. Приготовление стандартных образцов – трудоемкий и дорогостоящий процесс.

Содержание остаточного растворителя – метанола – в препарате антипирин определяют методом ГЖХ. Для приготовления анализируемого раствора