Работа 30. Аммонификация мочевины

Процесс аммонификации мочевины заключается в разложении мочевины ферментом уреазой, выделяемой уробактериями, с образованием карбоната аммония и далее конечных продуктов — аммиака, углекислого газа и воды. Этот процесс может быть схематично выражен следующей реакцией:

СО(NН₂)₂+2Н₂O > (NН₄)₂СO₃ > 2NН₃+СO₂+Н₂O

 

Материалы и оборудование

 

Питательная среда для уробактерий, колбы Эрленмейера, почва, навоз, скальпель, целлофан, резиновые колечки, красная лакмусовая бумага, реактив Несслера (см. приложение), микробиологическая петля, предметные стекла, спиртовка, водный раствор фуксина или генцианвиолета, пинцет, микроскоп, фарфоровая палетка, пипетки.

 

Ход работы

 

Для накопления уробактерий используют синтетическую среду следующего состава (г./л. дистиллированной воды):

калий либо натрий виннокислый, или яблочно-кислый, или лимоннокислый                                                                                                               —5,0

мочевина: СО(NН₂)₂                                                                                    —5,0

К₂НРO₄                                                                                                                                         —0,2

МgSO₄                                                                                                                   —0,5

Питательную среду готовят, исключая мочевину, и стерилизуют в автоклаве. Мочевину стерилизуют отдельно в автоклаве 30 мин при температуре 106°С и вводят в готовую питательную среду.

 

 

Работа 40. Брожение пектиновых веществ

Пектиновые вещества составляют основу срединных пластинок, склеивающих клетки в ткани. Различают три типа пектиновых веществ: протопектин— водонерастворимый компонент клеточной стенки; пектин и пектиновая кислота — водорастворимые полимеры галактуроновой кислоты.

Процесс разрушения пектиновых веществ начинается с ферментативного гидролиза, который вызывается бактериями, грибами и актиномицетами. Под действием фермента протопектиназы протопектин гидролизуется с образованием пектина. Пектинметилэстераза разрушает пектин до пектиновой кислоты и метилового спирта. Полигалактуронидаза разрушает пектин и пектиновую кислоту с образованием свободных молекул галактуроновой кислоты и других продуктов: ксилозы, арабинозы, галактозы, метилового спирта и уксусной кислоты. Схематично разрушение пектиновой кислоты можно выразить уравнением:

С_4бН₆₈О₄₀ + 10Н₂О > 4СОН(СНОН)₄СООН+С₅Н₁₀O₅ + С₅Н₁₀О₅ + С₆Н₁₂О₆ + 2СН₃ОН + 2СН₃СООН

Образующиеся углеводы в анаэробных условиях сбраживаются по типу маслянокислого брожения. Состав конечных продуктов определяется видом микроорганизма, ведущего процесс разрушения пектиновых веществ.

Пектиновое брожение лежит в основе промышленного получения волокна из технических культур: льна, конопли, джута, кенафа. Наиболее активно сбраживают пектиновые вещества бактерии рода Clostridium.

С l. pectinovorum представлен крупными палочковидными клетками (4—8 мкм), одиночными или в цепочках. Споры округлые, расположены терминально, спороносцы типичной плектридиальной формы. Оптимальная температура роста 30°С. Первым начинает процесс разрушения пектиновых веществ, но при накоплении органических кислот в среде прекращает активную деятельность.

Далее разрушение пектиновых веществ продолжает более кислотоустойчивый микроб — С l. felsineum. Он имеет вид более мелких палочковидных клеток (3—5 мкм), одиночных или расположенных парами. Споры овальные, формируются эксцентрично. Клетки - спороносцы клостридиального типа. Оптимальная температура роста 37°С. Культура С l. felsineum используется как закваска для активизации процесса анаэробной мочки прядильных растений. Закваска ускоряет процесс мочки и улучшает качество волокна.

В естественных условиях процесс росяной мочки прядильных растений идет благодаря деятельности аэробных микроорганизмов: Вас illus subtilis, Bacillus mesentericus и плесневых грибов Мисо r, Cladosporium, Alternaria. Разрушаются пектиновые вещества медленно, в течение 3—8 недель.

Материалы и оборудование

Стебли льна или крапивы, ножницы, нитки, большие пробирки, предметные и покровные стекла, пинцет, микробиологическая петля, скальпель, водные растворы фуксина или генцианвиолета, раствор иода в иодиде калия (реактив на гранулезу), большие пробирки с питательной средой Возняковской.

 

Ход работы

Рис. 29. Пектиноразрушающие бактерии: 1— Clostridium pectinovorum,2 — Clostridium felsineum. Карболовый фуксин.

Для выделения пектиноразрушающих бактерий используют льняную или крапивную питательную среду. Из стеблей льна или крапивы готовят снопики длиной 5—7 см и связывают их по концам ниткой. Снопики помещают в большие пробирки, заливают на ¹/₃ объема водопроводной водой и кипятят 10—15 мин.

Кипячением удаляют экстрактивные вещества, которые могут служить источником углерода для сопутствующих масляно-кислых бактерий. Воду сливают, снопики заливают новой порцией воды, пробирки плотно закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 мин. Когда пробирки остынут, среду заражают кусочком свежей соломы льна. Соломинку вставляют в середину снопика. Зараженные пробирки помещают в термостат при температуре 35°С.

Через 4—5 суток в пробирках начинается процесс пектинового брожения, жидкость заметно мутнеет и пенится. Выделяющиеся газы выносят снопик на поверхность среды. Брожение заканчивается через 1,5—2 недели, снопики вновь опускаются на дно.

Для изучения морфологии бактерий пектинового брожения готовят прижизненные препараты. Снопик вынимают из пробирки,  отжимают каплю жидкости со снопика на предметное стекло, добавляют каплю р-ра Люголя(иода в иодиде калия)

Рис. 29. Пектиноразрушающие бактерии: 1— Clostridium pectinovorum,2 — Clostridium felsineum. Карболовый фуксин.

накрывают покровным стеклом и микроскопируют, пользуясь объективом ВИ-40. На препарате видны клетки Clostridium pectinovorum и Clostridium felsineum, вегетативные и спорулирующие, окрашенные иодом в иодиде калия на гранулезу в темно-синий цвет (рис. 29).

 

Получение обогащенной культуры Clostridium felsineum по методу Возняковской

Для получения обогащенной культуры возбудителя тепловой мочки льна Clostridium felsineum Ю. М. Возняковская предлагает использовать специальную питательную среду. Состав среды (г/л дистиллированной воды):

Картофельная мезга, содержащая пектиновые вещества                    —54,0

кукурузный экстракт (источник аминокислот, фосфора и зольных элементов)                         —3,95

(NH₄)₂SO₄                                                                                                     —2

CaCO₃                                                                                                            —4

FeCl₃                                                                                           —0,375 мл 50% р-ра

Среду разливают высоким слоем в большие пробирки и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин. Заражают среду петлей суспензии пектиноразрушающих бактерий из льняной среды или кусочком свежей соломы льна. Зараженные пробирки помещают в термостат при температуре 35—37°С.

Процесс пектинового брожения заканчивается на 4—5-е сутки. В среде наблюдается почти полная мацерация картофельный мезги. Для изучения морфологии Clostridium felsineum из жидкости в пробирке готовят накопительные мазки, окрашивают их фуксином и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. Через 24—48 ч брожения на препаратах преобладают палочковидные вегетативные клетки Clostridium felsineum, клетки-спороносцы встречаются в небольшом количестве. На 4—5-е сутки на препаратах наблюдается масса спорулирующих клеток и свободнолежащих спор.

Получаемую таким образом культуру Clostridium felsineum используют в качестве закваски в промышленном производстве волокна на льнозаводах.